野木瓜多糖提取分离纯化及生物活性的研究

摘要

野木瓜(Chaenomeles cathayensis)属于蔷薇科(Rosaceae)木瓜属(Chaenomeles Lindl.)植物,是贵州省正安县的特色资源。野木瓜果实富含有机酸、氨基酸、蛋白质、碳水化合物、维生素和矿物质等多种元素和营养物质,并含有三萜皂苷、果胶、黄酮、超氧化物歧化酶(SOD)等活性成分,是一种食药两用的珍贵天然植物,在临床治疗及保健功能上均具有广泛的应用价值。本文以野木瓜为原料,优化野木瓜多糖(CCP)的提取工艺,并对其进行分离纯化、纯度鉴定、理化性质、结构分析及生物活性等方面较为系统的研究,为其应用提供理论依据和技术基础。主要研究内容及结果如下： 1、野木瓜多糖提取工艺的优化 采用水提醇沉法提取野木瓜水溶性多糖,在单因素实验的基础上,通过正交实验研究了提取温度、提取时间及料液比对野木瓜多糖提取率的影响,从而确定了野木瓜多糖的最佳提取工艺参数为：料液比1:30(W/V)、温度90℃、时间2.5h。最佳提取工艺条件下野木瓜粗多糖(CCCP)提取率为12.74％,纯度为43.16％。采用纤维素酶法提取野木瓜水溶性多糖,在单因素实验的基础上,通过正交实验研究了提取温度、提取时间、pH值及酶用量对野木瓜多糖提取率的影响,从而确定了酶法提取野木瓜多糖的最佳工艺参数为：提取温度50℃,pH值4.0,提取时间2.5h,酶用量50U/g。最佳提取工艺条件下CCCP提取率为17.42％,纯度为57.12％。 2、野木瓜多糖分离纯化 经脱蛋白、脱色、透析,得到野木瓜精多糖(FCCP),FCCP经过二乙氨基乙基(DEAE)纤维素离子交换色谱柱分离,用O→lmol/LNaCl溶液洗脱,得一野木瓜多糖0.2mol/mL NaCl洗脱组分,再通过透析、浓缩、冷冻干燥后为野木瓜多糖纯品CCP1。CCP1再经过纸层析、Sepharose Cl-6B凝胶柱层析和比旋光度测定三种方法进行纯度鉴定,结果表明CCP1为均一多糖,比旋光度为+54.17°,苯酚-硫酸比色法测定其纯度为97.30％。 3、野木瓜多糖理化性质 野木瓜多糖纯品CCP1为纤维状白色固体,可溶于热水、稀酸、稀碱,难溶于冷水,不溶于乙醇、丙酮、乙醚、正丁醇、氯仿等有机溶剂,水溶液粘度较大。CCP1苯酚-硫酸反应呈阳性,硫酸-咔唑反应呈阳性,费林试剂反应呈阴性,碘-碘酸钾反应呈阴性,考马斯亮蓝反应呈阴性,Molish反应呈阳性,三氯化铁反应呈阴性。实验表明CCP1是一种非还原性、不含多酚、不含蛋白质、不含淀粉而含有糖醛酸的酸性多糖,其糖醛酸含量为25.24％。 4、野木瓜多糖结构分析 采用凝胶渗透色谱法(GPC)测得CCP1的相对平均分子量Mw为2.879×106 Da。高效液相色谱法(HPLC)分析可知,CCP1由鼠李糖、阿拉伯糖、果糖、甘露糖和葡萄糖组成,其摩尔比为1:6.706:1.324:1.618:18.765。经UV、IR和1H-NMR分析可知,CCP1是β-糖苷键连接的吡喃环多糖。 5、野木瓜多糖体外抗氧化活性研究 野木瓜多糖具有抗氧化活性,CCCP、FCCP和CCP1具有体外清除·OH、O-2·和DPPH·的三重功效。抗氧化活性实验结果表明,其抗氧化活性随多糖浓度增加而增强。CCCP抗氧化活性最强,FCCP其次,CCP1抗氧化性相对较弱。野木瓜多糖对·OH、O-2·和DPPH·的清除能力依据IC50值弱于Vc。 6、野木瓜多糖免疫活性研究 考察FCCP对环磷酰胺(CTX)所致骨髓抑制小鼠免疫功能影响,实验结果表明,FCCP能提高正常小鼠和免疫低下小鼠的胸腺指数和脾腺指数；在CTX诱导的免疫和骨髓抑制状态下,高、中、低剂量的FCCP均对小鼠双侧股骨细胞数升高有促进作用；中剂量的FCCP在CTX所致的小鼠巨噬细胞功能低下对小鼠腹腔巨噬细胞的吞噬百分率和吞噬指数有显著提高,能拮抗CTX所致的小鼠巨噬细胞功能低下：实验结果表明FCCP可以提高环磷酰胺所致小鼠免疫低下的免疫功能。 对FCCP进行正常小鼠检测免疫活性,结果表明,FCCP在体外能够显著增强由刀豆素A(ConA)诱导的脾淋巴细胞增殖,且增值作用呈现剂量依赖性；FCCP能明显提高小鼠碳粒廓清速率；增强小鼠脾脏NK细胞的活性；另外,FCCP还具有显著的抗补体活性,并呈一定的剂量效应关系。免疫活性实验结果表明,FCCP是一种免疫调节剂,对正常和免疫低下小鼠的免疫功能具有促进作用。 上述研究结果表明,从野木瓜中以优化工艺提取的水溶性多糖,具有抗氧化和免疫调节等生理活性,而野木瓜多糖的抗氧化和免疫活性与抗肿瘤、抗突变、降血脂、抗病毒等功能密切相关,因此野木瓜多糖显示出广阔的应用前景。

目录

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论文说明：论文缩略词表

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第一章绪论

1.1研究的背景

1.1.1木瓜的资源情况

1.1.2野木瓜资源开发利用情况

1.1.3木瓜的化学成分

1.1.4木瓜的药理作用

1.2多糖研究概述

1.3植物多糖的提取

1.3.1热水浸提法

1.3.2酸浸提法

1.3.3碱浸提法

1.3.4酶浸提法

1.3.5超声辅助提取

1.3.6微波辅助提取

1.4多糖的分离纯化

1.4.1除蛋白质

1.4.2除色素

1.4.3除低聚糖等小分子

1.4.4多糖的纯化

1.4.5多糖的纯度鉴定

1.4.6多糖含量的测定

1.4.7多糖的分子量测定

1.5多糖的结构

1.5.1多糖的一级结构

1.5.2多糖的二级结构

1.5.3多糖的三级和四级结构

1.6多糖的结构鉴定

1.6.1多糖一级结构的测定方法

1.6.2多糖高级结构的测定方法

1.7多糖的生物活性

1.7.1免疫调节

1.7.2抗肿瘤

1.7.3抗病毒

1.7.4降血糖

1.7.5降血脂

1.7.6抗血凝

1.7.7抗衰老

1.7.8抗氧化

1.7.9抗炎

1.7.10抗溃疡

1.7.1l抗辐射

1.7.12抗突变

1.8多糖的构效关系

1.8.1一级结构与生物活性的关系

1.8.2高级结构与生物活性的关系

1.8.3理化性质与生物活性的关系

1.8.4活性部位与生物活性的关系

1.9多糖的分子修饰

1.9.1化学方法修饰

1.9.2生物修饰方法

1.9.3物理方法修饰

1.10多糖的应用研究

1.10.1多糖在药物上的应用

1.10.2多糖在食品中的应用

1.10.3多糖在化妆品中的应用

1.10.4其他应用

1.11本课题的立题背景、研究意义及主要研究内容

1.11.1立题背景和研究意义

1.11.2主要研究内容

第二章野木瓜多糖提取工艺研究

2.1实验材料

2.1.1原料

2.1.2实验试剂

2.1.3实验仪器

2.2实验方法

2.2.1野木瓜多糖的溶剂浸提原理

2.2.2苯酚-硫酸法测定野木瓜中多糖含量

2.2.3野木瓜水溶性多糖热水提取工艺研究

2.2.4野木瓜水溶性多糖酶法提取工艺研究

2.3实验结果

2.3.1苯酚-硫酸法测定野木瓜中多糖含量

2.3.2野木瓜水溶性多糖热水提取工艺研究

2.3.3酶法提取野木瓜多糖的工艺研究

2.4结果讨论

2.5本章小结

第三章野木瓜多糖分离纯化研究

3.1实验材料

3.1.1原料

3.1.2实验试剂

3.1.3实验仪器

3.2实验方法

3.2.1野木瓜水溶性多糖分离纯化工艺路线

3.2.2多糖含量测定

3.2.3考马斯亮蓝染色法测定蛋白质含量

3.2.4脱脂

3.2.5脱蛋白质

3.2.6脱色

3.2.7透析

3.2.8分级

3.2.9凝胶过滤色谱法

3.2.10纸层析

3.2.11比旋光度的测定

3.3实验结果

3.3.1野木瓜粗多糖的制备

3.3.2考马斯亮蓝染色法测定野木瓜粗多糖中蛋白质含量

3.3.3脱蛋白质方法的确定

3.3.4脱色方法确定

3.3.5透析

3.3.6分级

3.3.7纯度鉴定

3.4本章小结

第四章野木瓜多糖理化性质及化学结构研究

4.1实验材料

4.1.1原料

4.1.2实验试剂

4.1.3实验仪器

4.2实验方法

4.2.1一般性质

4.2.2分子量测定

4.2.3多糖的单糖组成测定

4.2.4紫外光谱分析

4.2.5红外光谱分析

4.2.61H-NMR谱分析

4.3实验结果

4.3.1多糖的一般性质

4.3.2分子量测定

4.3.3多糖的单糖组成测定

4.3.4多糖的紫外光谱分析

4.3.5多糖的红外光谱分析

4.3.6多糖的1H-NMR分析

4.4本章小结

第五章野木瓜多糖抗氧化作用的研究

5.1实验材料

5.1.1材料

5.1.2实验试剂

5.1.3实验仪器

5.2实验方法

5.2.1野木瓜多糖清除·OH的测定

5.2.2野木瓜多糖清除O2-·的测定

5.2.3野木瓜多糖清除DPPH·的测定

5.2.4统计分析

5.3实验结果

5.3.1野木瓜多糖清除·OH的测定结果

5.3.2野木瓜多糖清除O2-·的测定结果

5.3.3野木瓜多糖清除DPPH·的测定结果

5.4结果讨论

5.4.1多糖抗氧化活性的研究方法

5.4.2多糖抗氧化作用的机理

5.4.3多糖抗氧化保健食品及药品的开发研究

5.5本章小结

第六章野木瓜多糖免疫调节功能的研究

6.1实验材料

6.1.1材料

6.1.2实验试剂

6.1.3实验仪器

6.2实验方法

6.2.1野木瓜多糖对环磷酰胺所致骨髓抑制小鼠免疫功能影响研究

6.2.2小鼠碳粒廓清实验

6.2.3 ConA诱导的小鼠脾淋巴细胞转化试验(MTT法)

6.2.4 NK细胞活性检测(LDH法)

6.2.5血清总补体溶血活性(TCH50)测定

6.2.6抗补体活性测定

6.2.7统计分析

6.3实验结果与讨论

6.3.1野木瓜精多糖对环磷酰胺所致骨髓抑制小鼠免疫功能影响

6.3.2野木瓜精多糖对小鼠碳粒廓清能力的影响

6.3.3野木瓜精多糖对正常小鼠脾淋巴细胞增殖作用的影响

6.3.4野木瓜精多糖对NK细胞活性的影响

6.3.5野木瓜精多糖抗补体活性研究

6.4本章小结

结论与展望

一、结论

二、创新之处

三、展望

参考文献

攻读博士学位期间取得的研究成果

致谢