纤维堆囊菌高产埃博霉素发酵条件与提取工艺优化研究

摘要

纤维堆囊菌是隶属粘细菌目的革兰氏阴性细菌，它们是一类具有复杂社会行为和多细胞发育过程的、寄生或腐生于土壤中的细菌。埃博霉素（Epothilone）是由粘细菌属的纤维堆囊菌合成的次级代谢产物，它们能强烈抑制微管的解聚作用，具有与抗癌药物紫杉醇类似的作用机制。但与紫杉醇相比，埃博霉素具有更高的水溶性，而且能够抑制紫杉醇抗性肿瘤细胞系的生长，这使得埃博霉素被定位是下一代治疗癌症的化疗药物。本论文的研究主要围绕埃博霉素发酵培养基的优化及其提取工艺流程优化展开。
　　 为了提高埃博霉素的产量，在单因素试验的基础上，采用响应面法建立了埃博霉素发酵培养基和培养条件的二阶数学模型，并验证了模型的有效性；筛选出了3个影响纤维堆囊菌发酵生产埃博霉素的主要因素：转速、初始pH值和培养温度；确定了优化的发酵条件：转速180r/min、初始pH值7．8、马铃薯淀粉20g/L、酵母膏10g/L、Na-Fe-EDTA 8mg/L、培养温度29℃、接种量10％。
　　 对提取工艺过程中的3个关键点进行了优化，首先，研究表明在发酵120h～144h之间埃博霉素含量达到最高，由此确定了为树脂收获时间；第二，确定了在发酵48h左右加入树脂，并对树脂加入量进行了优化，确定了树脂的添加量为2％；第三，确定了由乙酸乙酯作为吸附剂有较高的埃博霉素产率。在实验室摇瓶条件下获得优化的发酵培养基和发酵条件后，以马铃薯淀粉为20 g/L、酵母膏10 g/L、Na-Fe-EDTA 8 mg/L为发酵培养基，以50％的罐装量，灭菌后的初始pH为7．8，温度为30℃，溶解氧保持在30％以上，通气量在1V/V·min左右的发酵条件进行培养，最终得出，在小试条件下（2L发酵罐），埃博霉素在120h～144h之间可以获得最高产量，为16．54mg/L。

目录

文摘

英文文摘

声明

第一章 前言

1.1 粘细菌

1.1.1 粘细菌的系统分类

1.1.2 粘细菌的典型特征

1.1.3 粘细菌的生物活性物质

1.1.4 纤维堆囊菌属及其次级代谢产物

1.2 埃博霉素

1.2.1 埃博霉素简介

1.2.2 埃博霉素作用机制

1.2.3 埃博霉素的定量构效关系(QSAR)

1.2.4 埃博霉素结构类似物的结合亲和力、微管稳定性与细胞毒力的关系

1.2.5 埃博霉素合成的基因簇

1.2.6 埃博霉素在培养细胞系中的抗性

1.2.7 埃博霉素的研究现状

1.3 发酵生产工艺条件研究

1.4 次级代谢产物埃博霉素的提取研究

1.5 本课题研究的意义和主要内容

1.5.1 本课题研究的意义

1.5.2 本课题研究的主要内容

第二章 埃博霉素的发酵优化

2.1 前言

2.2 材料与设备

2.2.1 菌种

2.2.2 主要培养基配方

2.2.3 主要仪器

2.2.4 主要试剂

2.3 实验方法

2.3.1 菌株的活化

2.3.2 培养方法

2.3.3 Epothilone B的提取方法

2.3.4 Epothilone B的检测

2.3.5 实验设计

2.4 结果与分析

2.4.1 PB试验设计

2.4.2 最陡爬坡试验

2.4.3 中心组合设计

2.4.4 响应面结果分析

2.5 小结

第三章 埃博霉素提取方法与条件优化

3.1 前言

3.2 实验材料与设备

3.2.1 主要仪器设备

3.2.2 主要培养基配方

3.2.3 主要试剂配方

3.2.4 主要试剂

3.3 实验方法

3.3.1 Epothilone B标准曲线的测定

3.3.2 吸附剂预处理

3.3.3 优化解吸附实验方法

3.4 结果与讨论

3.4.1 Epothilone B标准曲线的绘制

3.4.2 Epothilone B提取时间的优化

3.4.3 吸附树脂添加量的优化

3.4.3 提取剂优化实验

3.5 小结

第四章 2L罐埃博霉素发酵小试研究

4.1 前言

4.2 材料与设备

4.2.1 菌种

4.2.2 培养基

4.2.3 主要试剂

4.2.4 主要仪器

4.3 实验方法

4.3.1 发酵培养基的制备

4.3.2 发酵液中菌体浓度的测定

4.3.3 发酵液pH值的测定

4.3.4 发酵液DO值的测定

4.3.5 发酵液埃博霉素含量的测定

4.3.6 Sartorius 2L发酵罐操作流程

4.4. 结果与讨论

4.5 小结

结论与展望

参考文献

攻读学位期间发表的与学位论文相关的学术论文

致谢