基于ARMS、PCR-RFLP及DNA探针技术的何首乌(Fallopia multiflora)分子鉴别

摘要

何首乌（Fallopia multiflora）是一种多年生缠绕草本蓼科植物，其块根（何首乌）和藤茎（夜交藤）都可作药用。作为一种著名的的大宗中草药材，具有抗氧化、抗肿瘤、降胆固醇、抑菌消炎及增强记忆等功效。但多种混淆品如毛脉蓼（Fallopia． multiflora var。cillinerve）、翼蓼（Pteroxygonum giraldii）、耳叶牛皮消（Cynanchum auriculatum）等的存在影响了何首乌的用药安全和用药质量。
　　 中药材的真淆鉴定是对其进行质量控制的首要环节。现有的何首乌鉴别方法多是基于其外观性状、显微结构或化学成份等建立其鉴别标识。这些标识都是物种的遗传表现型，易受到多种内在及外在因素的影响，存在主观性强、重复性和稳定性差等不足。因此建立一种简易、客观而稳定的基于物种间遗传基因多态性的何首乌分子鉴别技术具有重要意义。
　　 本研究以常用药材何首乌，何首乌近缘种及何首乌混淆品为研究材料，以它们的遗传基因之间的差异为基础，通过nrDNA ITS序列、trnL-trnF序列的测序比对，抑制消减杂交（SSH）等方法找出了多个何首乌特征性分子标记，并利用这些分子标记建立了ARMS、PCR-RFLP（PCR-restriction fragment length polymorphism）、DNA探针的反向斑点杂交等多种何首乌分子鉴别方法。这些鉴别方法的建立是传统鉴别方法的重要补充，并为其它中药材品种的特征性分子标记寻找和鉴别方法的建立提供了模式借鉴。本文的主要研究结果如下：
　　 （1）通过何首乌、何首乌近缘种及常见混淆品的nrDNA ITS序列及trnL-trnF序列的测序比对，分析了何首乌与其近缘种及常见混淆品之间的亲缘关系和变异规律。结果表明：混淆品毛脉蓼与何首乌遗传关系最近，混淆品翼蓼则和何首乌属植物齿叶蓼最为接近；何首乌各居群之间的种内变异小于何首乌属植物之间的种间变异，这为何首乌特征性分子标记的发掘和分子鉴别方法的建立提供了更为可行的分子基础。
　　 （2）基于何首乌与其近缘种及常见混淆品的nrDNA ITS序列差异建立了何首乌的ARMS分子鉴别方法。对何首乌与其近缘种及常见混淆品的nrDNA ITS序列进行比对，根据其序列间的差异，设计了一对何首乌种特异性引物PMITS29/PMITS544，运用这对引物对何首乌与其近缘种及常见混淆品进行特异引物PCR，结果表明：从所有的何首乌植物样品和药材中可以扩增出条带为516 bp的种特异性条带；而其近缘种及混淆品均无扩增。根据电泳图谱，可以对何首乌与其近缘种及其混淆品进行鉴别。
　　 （3）基于何首乌与其近缘种及常见混淆品的nrDNA ITS和trnL-trnF序列差异建立了何首乌PCR-RFLP分子鉴别方法。用NsbⅠ酶对何首乌nrDNA ITS序列扩增产物酶切后得到得含约531 bp和109 bp的二片段PCR-RFLP图谱，用XbaⅠ酶对何首乌trnL-trnF序列扩增产物酶切后则得到大小约为800 bp和256 bp的二个片段。何首乌属其它植物种类及其混淆品nrDNA ITS和trnL-trnF序列因其中没有相应的XbaⅠ或NsbⅠ酶识别位点而不能被酶切，PCR-RFLP图谱呈单一条带，从而可以很好地对何首乌及其近缘种和混淆品植物进行区分。
　　 （4）通过SSH获得了种特异性DNA探针。以何首乌做测试子，以毛脉蓼作为驱动子进行的抑制消减杂交（SSH）共获得了5个阳性差减克隆，对这5个差减克隆进行差减片段的扩增测序后得到4条（其中2条序列完全一致）长度为200～250 bp之间的序列。这些序列被后续实验证明为何首乌所特有，可用作何首乌种特异性探针。
　　 （5）根据4个何首乌种特异性探针序列设计了4对何首乌鉴别引物。用这4对引物能从何首乌植物样品及药材gDNA中扩增出相应长度的特征性片段，而从毛脉蓼及其它何首乌近缘种及混淆品gDNA中则不能扩增出相应片段，从而得到区分。基于差减片段设计的何首乌种特异性引物敏感而稳定，并因其扩增片段短，更适合于DNA降解严重的何首乌药材。
　　 （6）应用种特异DNA探针对何首乌进行鉴定。用地高辛对获得的何首乌种特异DNA探针进行标记后，与何首乌及何首乌近缘种及混淆品基因组组成的DNA阵列进行杂交，结果只能从代表何首乌种的样点检测出杂交信号。模拟中药鉴别DNA芯片的方法，用地高辛对何首乌及其它物种的gDNA进行标记后与4种何首乌种特异性探针组成的DNA探针阵列进行反向斑点杂交，结果显示只有标记的何首乌基因组能和探针阵列杂交并获得杂交信号。

目录

文摘

英文文摘

声明

第一章 绪论

1.1 中药鉴定在中药质量控制中的地位和作用

1.1.1 天然药物的复兴与中药现代化

1.1.2 中药品种鉴定是中药质量控制体系的首要环节

1.1.3 中药品种鉴定是一项长期而艰巨的任务

1.2 中药鉴定技术发展的特点

1.2.1 中药品种分类鉴定依据由外在表型到内部基因

1.2.2 研究范围从物种间深入到物种内

1.2.3 研究手段不断推陈出新

1.2.4 研究思路呈现多元化

1.3 中药鉴定的传统方法及其应用

1.3.1 基原鉴定法

1.3.2 性状鉴定法

1.3.3 显微鉴定法

1.3.4 理化鉴定法

1.3.5 生物鉴定法

1.4 DNA分子遗传标记鉴定法

1.4.1 技术原理

1.4.2 中药鉴定常用DNA分子标记技术

1.5 何首乌概述

1.5.1 何首乌的分类地位及其形态特征

1.5.2 主要成分研究

1.5.3 药理研究及临床应用

1.5.4 何首乌资源现状

1.6 何首乌混淆品及其真淆鉴定

1.6.1 何首乌混淆品种类

1.6.2 何首乌混淆品出现的原因分析

1.6.3 何首乌真淆鉴定研究现状

1.7 本文的研究目标、内容和技术路线

1.7.1 研究目标

1.7.2 研究内容

1.7.3 技术路线

参考文献：

第二章 何首乌及其近缘种和(或)混淆品植物nrDNA ITS及trnL-trnF序列分析

2.1 材料与方法

2.1.1 植物样本的采集和鉴定

2.1.2 主要试剂

2.1.3 所需仪器

2.1.4 DNA提取

2.1.5 nrDNA ITS区片段的PCR扩增、纯化及序列测定

2.1.6 trnL-trnF序列的PCR扩增、纯化及序列测定

2.1.7 数据分析

2.2 结果与分析

2.2.1 DNA提取

2.2.2 nrDNA ITS、trnL-trnF序列的PCR扩增和测序结果

2.2.3 何首乌种内ITS序列分析

2.2.4 何首乌种内trnL-trnF序列分析

2.2.5何首乌与其近缘植物和混淆品间的的ITS序列种间变异

2.2.6 何首乌及其近缘植物和(或)混淆品的trnL-trnF序列种间变异

2.2.7 基于nrDNA ITS和trnL-trnF序列的聚类分析

2.3 讨论

2.4 本章小结

参考文献：

第三章 基于nrDNA ITS序列分析的何首乌ARMS分子鉴别

3.1 材料与方法

3.1.1 材料

3.1.2 主要试剂

3.1.3 所需仪器

3.1.4 DNA提取

3.1.5 rDNAITS序列的分析及引物的设计

3.1.6 何首乌鉴别引物PCR条件的建立

3.1.7 何首乌ARMS鉴别方法的可靠性试验

3.2 结果与分析

3.2.1 何首乌药材DNA提取

3.2.2 引物设计

3.2.3 鉴别引物PCR退火温度的选择

3.2.4 何首乌的ARMS鉴别

3.3 讨论

3.4 本章小结

参考文献：

第四章 基于nrDNAITS、trnL-trnF序列分析的何首乌PCR-RFLP分子鉴别

4.1 材料与方法

4.1.1 材料

4.1.2 主要试剂

4.1.3 所需仪器

4.1.4 rDNAITS、trnL-trnF序列的酶谱分析

4.1.5 DNA提取、nrDNAITS及trnL-trnF序列的扩增和纯化。

4.1.6 酶切反应

4.2 结果与分析

4.2.1 rDNAITS、trnL-trnF序列的酶切分析

4.2.2 基于nrDNA ITS序列的何首乌PCR-RFLP分子鉴别

4.2.2 基于trnL-trnF序列的何首乌PCR-RFLP分子鉴别

4.3 讨论

4.4 本章小结

参考文献

第五章 何首乌种特异DNA探针的筛选

5.1 材料与方法

5.1.1 材料

5.1.2 主要试剂

5.1.3 所需仪器

5.1.4 抑制差减杂交筛选DNA探针技术流程

5.1.5 何首乌(BK)、毛脉蓼基因组DNA的酶切、纯化

5.1.5 SSH所需接头的合成

5.1.6 何首乌gDNA酶切产物和接头进行连接

5.1.7 抑制差减杂交

5.1.8 差减产物的PCR扩增

5.1.9 差减产物的纯化

5.1.10 差减PCR产物的克隆

5.1.11 差减克隆的扩增

5.1.12 差异片段(DNA探针)的标记

5.1.12 DNA探针标记效率的检测

5.1.13 用于筛选探针的gDNA微阵列的制备

5.1.14 DIG标记的差减克隆与gDNA徽阵列的杂交

5.2 结果与分析

5.2.1 何首乌、毛脉蓼gDNA Rsa Ⅰ酶切效果

5.2.2 差减杂交及PCR扩增产物检测

5.2.3 差减杂交PCR产物的克隆

5.2.4 DNA探针标记效率

5.2.5 探针特异性与筛选效率分析

5.3 讨论

5.4 本章小结

参考文献

第六章 何首乌差减克隆的测序与引物设计

6.1 材料与方法

6.1.1 材料

6.1.2 主要试剂

6.1.3 所需仪器

6.1.4 差减克隆目标片段的扩增和测序

6.1.5 探针的序列分析和何首乌特异引物的设计

6.1.6 探针引物PCR退火温度的选择

6.1.7 何首乌特异引物PCR鉴别

6.2 结果与分析

6.2.1 差减克隆扩增和测序

6.2.2 探针的序列分析和何首乌特异引物的设计

6.2.3 探针引物PCR退火温度的选择

6.2.4 何首乌的特异引物PCR鉴别

6.3 讨论

6.4 本章小结

参考文献

第七章 何首乌DNA探针阵列的制备与样品的检测

7.1 材料与方法

7.1.1 材料

7.1.2 主要试剂

7.1.3 所需仪器

7.1.4 DNA提取

7.1.5 gDNA的酶切与纯化。

7.1.6 gDNA的标记

7.1.7 何首乌DNA探针阵列的制备

7.1.8 DIG标记的gDNA和DNA阵列的杂交

7.1.9 杂交结果的检测

7.2 结果与分析

7.2.1 试验样本gDNA酶切效果

7.2.2 杂交温度的优化分析

7.2.2 探针阵列对样品的检测

7.3 讨论

7.4 本章小结

参考文献

结论与展望

1 结论

2 本论文的创新点

3 展望

附录

攻读博士学位期间取得的研究成果

致谢