明睛颗粒对骨髓来源细胞参与脉络膜新生血管形成的干预作用研究

摘要

目的:
　　观察明睛颗粒对激光诱发脉络膜新生血管(CNV)后对骨髓来源细胞动员,及在脉络膜新生血管趋化和黏附、分化的影响,探讨明睛颗粒对骨髓来源细胞参与脉络膜新生血管形成的干预作用。
　　方法:
　　1.将氪激光诱导脉络膜新生血管的C57BL/6小鼠随机分为治疗组和模型对照组，以正常小鼠作正常对照组。采用流式细胞仪检测小鼠在治疗后7 d、14 d、28 d外周血的CD34+细胞百分数，ELISA方法检测外周血粒-巨噬细胞集落刺激因子（GM-CSF）、血管生长因子（VEGF）、粒细胞集落刺激因子(G-CSF)、基质金属蛋白酶-9(MMP-9)、血小板反应蛋-1(TSP-1)、血管内皮钙粘蛋白(VE-cadherin)的含量。
　　2.采用氪激光诱导C57BL/6小鼠脉络膜新生血管发生，激光后给予尾静脉注射GFP小鼠的骨髓细胞，随后将小鼠随机分为治疗组和对照组，治疗组小鼠予以明睛颗粒溶剂每日灌胃，对照组予以蒸馏水灌胃。分别在在治疗后7天，14天及28天，采用脉络膜铺片观察脉络膜新生血管及移植骨髓细胞在脉络膜新生血管处归巢情况，光镜观察小鼠视网膜脉络膜组织病理改变，用眼底荧光血管造影在治疗后28天观察脉络膜新生血管情况。ELISA检测小鼠外周血基质细胞衍生因子1α(SDF-1α）、趋化因子受体4(CXCR4)的含量，免疫荧光法观察基质细胞衍生因子-1（SDF-1α）、血管细胞黏附分子（VCAM-1）、细胞间黏附分子（ICAM-1）在CNV区域的表达, RT-PCR观察眼部VEGF的表达。
　　3.采用氪激光诱导 C57BL/6小鼠脉络膜新生血管发生，激光后给予尾静脉注射 GFP小鼠的骨髓细胞，随后将小鼠随机分为治疗组和对照组，治疗组小鼠予以明睛颗粒溶剂每日灌胃，对照组予以蒸馏水灌胃。分别在在治疗后7天，14天,免疫荧光双染法观察 CNV区域的GFP,CD31,α-SMA,F4/80,RPE65表达情况，观察明睛颗粒对 CNV中BMCs分化的影响。
　　结果:
　　1.治疗后7 d、14 d，模型对照组外周血 CD34+细胞数明显高于治疗组及正常组（P<0.05），治疗组和正常组差异无统计学意义（P>0.05）；治疗组外周血 GM-CSF及VEGF含量均明显低于模型对照组和正常组(P<0.05)；治疗后7 d对照组和治疗组外周血TSP-1含量均较空白组降低,且治疗组高于对照组(P<0.05)。
　　2.小鼠实验眼光凝后,120只眼1060个激光点中,850个光斑中央有气泡生成(80.1%),正常无出血；治疗后第7天，14天，脉络膜铺片中显示治疗组CNV中骨髓来源细胞明显少于对照组，CNV面积亦较对照组小；光镜观察治疗组视网膜脉络膜病变程度较对照组明显减轻；治疗后第7天，ELISA检测发现治疗组外周血SDF-1、CXCR4明显低于对照组（P<0.05）；免疫荧光检测显示治疗后第7天、14天及28天治疗组CNV区域SDF-1α，ICAM-1,VCAM-1表达较对照组减弱。
　　3.免疫荧光双标检测显示，CNV内BMCs也可分化为RPE细胞,血管内皮细胞,巨噬细胞,血管平滑肌细胞。治疗后第7天,第14天,治疗组CNV区域内GFP+细胞数明显低于对照组(P<0.05),治疗组GFP+细胞转化的CD31+细胞数比对照组明显减少(P<0.05),治疗组RPE65+数细胞比对照组明显减少；治疗后第7天,治疗组中由GFP+细胞转化的F4/80+细胞数比对照组明显减少(P<0.05),但是这4种细胞与GFP+细胞构成比,即各细胞分化率比较无显著差异(P>0.05）。
　　结论:
　　初步显示明睛颗粒能在早期抑制CNV小鼠外周血骨髓干细胞的动员，并能在CNV形成早期减少外周血及CNV周围趋化因子和粘附因子的蛋白表达,抑制外周血骨髓干细胞在CNV处黏附和趋化,从而抑制新生血管。明睛颗粒可以使CNV区域内BMCs细胞减少,在早期能减少CNV区域内的RPE细胞、内皮细胞、巨噬细胞数,但是不能降低BMCs向内皮细胞、RPE细胞、巨噬细胞的分化率。

目录

声明

引言

第一章 文献回顾

综述一:年龄性相关黄斑病变的研究进展

综述二:骨髓来源细胞参与脉络膜新生血管形成的研究进展

第二章 明睛颗粒对激光诱导小鼠CNV后骨髓来源细胞动员的影响

1 前言

2 材料与方法

3 结果

4 讨论

第三章 明睛颗粒对激光诱导小鼠CNV后骨髓来源细胞在脉络膜趋化和黏附的影响

1.引言

2 主要材料、试剂和仪器

3.实验方法

4.结果

5.讨论

第四章 明睛颗粒对激光诱导小鼠CNV后骨髓来源细胞在脉络膜分化的影响

1 引言

2 主要材料、试剂和仪器

3.实验方法

4.结果

5.讨论

结语

参考文献

附录

研究生在学期间发表论文情况

致谢