基于补肾益精法复方的黄芪甲苷对硬皮纤维化的作用及机制研究

摘要

目的:
　　观察基于补肾益精法中药复方的黄芪甲苷对系统性硬皮病成纤维细胞的影响，并通过测量成纤维细胞Collagen I，Fibronectin、Smad3、Flil及其mRNA的变化来进一步阐明硬皮病的发病机理，探索硬皮病治疗新的干预靶点，为现代硬皮病治疗提供新的思路和途径。
　　方法:
　　体外层面，分离、培养来自系统性硬皮病患者皮损和健康人对应部位的皮肤原代成纤维细胞，用补肾益精法复方含药血清、黄芪甲苷、PBS溶液分别处理两组细胞，采用Western Blot技术检测各组细胞Collagen I，Fibronectin，Smad3与Fli1蛋白表达水平，RT-PCR检测Collagen I，Fibroneetin，Smad3与Fli1的mRNA表达，免疫荧光技术检测Smad3的活性与定位的调节。体内层面，用博莱霉素诱导的硬皮病小鼠模型采用同样方法进行体内实验，并进行病理组织切片、染色，观察小鼠皮肤病理变化，评价效果。
　　结果:
　　1.成功建立硬皮病小鼠模型:与正常对照组相比，硬皮病模型组中CollagenI、Fibronectin的mRNA均增加(p＜0.05);与硬皮病模型组相比，补肾益精法中药复方、黄芪甲苷干预的硬皮病小鼠的CollagenI、Fibronectin的mRNA均降低(p＜0.05)。
　　2.成功构建硬皮病成纤维细胞系:和NF相比，SScF中CollagenI、Fibronectin的mRNA均增加(p＜0.05);和SScF相比，不同浓度干预的SScF的CollagenI、Fibronectin的mRNA均降低(p＜0.05)。
　　3.和NF相比，SScF中Fli1的mRNA的表达明显降低(p＜0.05);和SScF相比，经不同浓度的黄芪甲苷干预的SScF的Fli1的mRNA上调(p＜0.05)。
　　4.与NF相比，Smad3在硬皮病成纤维细胞中经补肾益精法中药复方及黄芪甲苷干预前后变化不明显(p＞0.05);P-Smad3显著增加，黄芪甲苷干预的硬皮病成纤维细胞，P-Smad3的水平下降，一定程度上抑制Smad3转入胞核与辅助因子结合激活TGF-β转录基因。
　　结论:
　　基于补肾益精法中药复方的黄芪甲苷可改善硬皮病皮肤纤维化程度，抑制成纤维细胞细胞外基质的过度生成，下调P-Smad3的水平，上调Fli1的水平，对硬皮病成纤维细胞表型的影响可能与二者能够调节TGF-β/Smad3/Fli1通路有关。

目录

声明

摘要

引言

第一章 研究背景

1．1 硬皮病与成纤维细胞

1．2 硬皮病的病因病机及补肾益精法在硬皮病中的应用

1．3 黄芪的主要成分黄芪甲苷的现代研究

1．4 TGF-β、Smad3、Fli1与硬皮病

1．5 前期研究提示

1．5．1 体外细胞疾病模型层面

1．5．2 体外细胞疾病模型层面

第二章 实验研究

2．1 实验材料

2．1．1 硬皮病患者成纤维细胞来源

2．1．2 实验动物

2．1．3 主要试剂

2．1．4 主要仪器

2．1．5 试验药物

2．2 方法

2．2．1 实验分组

2．2．2 细胞模型的构建

2．2．3 动物造模

2．2．4 黄芪甲苷药液

2．3 观察指标及实验步骤

2．3．1 一般情况观察

2．3．2 皮肤组织病理学制作、HE染色

2．3．3 Masson染色

2．3．4 检测指标

2．4 统计学方法

2．5 结果

2．5．1 体内细胞疾病模型层面

2．5．2 体外细胞疾病模型层面

2．6 讨论

2．6．1 硬皮病的概述

2．6．2 补肾益精法中药复方对Collα2、Fibronectin、Smad3与FLi1的影响

2．6．3 黄芪甲苷在SSc鼠模型中的抗纤维化作用

结语

参考文献

致谢