岭南温病湿热证小鼠模型的建立及肠道相关湿热证实质的研究

摘要

目的:
　　湿热证是岭南地区常见的体质类型和疾病发病类型，岭南地区沿海湿气大，山川丘陵众多使湿邪不散易与热邪相合而攻于人体。薛生白《湿热病篇》指出“太阴内伤，湿饮停聚，客邪再至，内外相引，故病湿热”，湿热证的发病机制存在着脾胃内伤的诱因，故岭南地区高蛋白的饮食习惯可能与脾胃内伤有特殊的相关性。本研究拟通过建立具有岭南特色的温病湿热证小鼠模型为研究温病湿热证的基础，探索温病湿热证的肠道菌群组成变化规律、体内炎症反应状态和水通道蛋白的改变情况，选择清热利湿代表方茵陈蓠汤进行反证，并探索茵陈蒿汤的清热利湿机制，推进中医药治疗温病湿热证的科学性的发展。
　　方法:
　　建立两种不同发病机制的岭南温病湿热证小鼠模型:通过运用“高蛋白饲料+糖水”模拟岭南饮食习惯特点，模型A组给予油脂灌胃模拟好食肥甘厚腻之人群，模型B组则给予番泻叶灌胃模拟常服清热解毒之品人群，酒的作用为加剧内湿热程度，综合以上形成内湿热因素;气候箱模拟岭南外环境的湿度温度，再加于LPS的腹腔注射模拟外来戾气，以“内伤湿热+外伤湿热+外来疬气”的模式建立岭南温病湿热证小鼠模型，用HE染色法来观察小鼠舌苔和结肠组织学的改变、用ELISA法检测血清和结肠LPS、TNF-α的含量变化、用相对定量PCR法检测小鼠粪便中五种肠道细菌的含量变化、用RT-PCR法检测结肠组织TLR4、CD14、AQP3、AQP8的表达水平变化。选择茵陈蒿汤对建立的两种温病湿热证小鼠模型进行反证治疗，并通过血清TNF-α的含量的检测和结肠组织TLR4、CD14的表达变化来探索茵陈蒿汤清热作用的炎症信号通路机制，通过结肠组织AQP3、AQP8的表达变化来探索茵陈蒿汤利湿作用的机制。
　　结果:
　　两种岭南温病湿热证小鼠模型均出现了湿热证相关的症状体征，血清、结肠TNF-α均出现明显升高(P＜0.05)，提示温病湿热证模型建模成功。模型完成初期(6h)，模型A组血清LPS含量低于单纯LPS组(P＞0.05)，模型B组血清LPS含量低于单纯LPS组(P＜0.05)，推测可能是两组模型均出现过肠道细菌移位入血，细菌LPS使机体产生了LPS耐受，引起模型组血液内LPS含量降低;两组模型结肠组织TLR4mRNA、CD14mRNA转录水平均出现升高，结肠组织AQP3 mRNA转录水平出现降低，AQP8 mRNA转录水平出现升高，提示了温病湿热证出现TLR4通路的激活和水通道蛋白表达的紊乱。
　　两种温病湿热证模型肠道菌群的检测结果显示，两组模型均出现大肠杆菌属、肠球菌属、梭菌属含量增加，大肠杆菌属含量升高最为明显;双歧杆菌属和乳杆菌属含量的表达存在差别，模型A组双歧杆菌属和乳杆菌属出现含量增加而模型B组双歧杆菌属和乳杆菌属出现含量降低;以上提示温病湿热证存在肠道菌群的失调。
　　茵陈蒿汤的清热机理探索，茵陈蒿汤治疗7天后，治疗组A组、治疗组B组的小鼠相关湿热证症状体征出现明显改善。研究结果显示，治疗组A组、治疗组B组血清中TNF-α含量均低于盐水组A组、盐水组B组(P＜0.05)，提示茵陈蒿汤有抗炎的效果;相比盐水组A组、盐水组B组，治疗A组、治疗B组的结肠组织TLR4mRNA、CD14mRNA转录水平均出现不同程度的下降，提示茵陈蒿汤抗炎的作用机制之一是通过TLR4通路来下调TLR4mRNA、CD14 mRNA转录水平而实现，抗炎可能是茵陈蒿汤清热作用的机制之一。
　　茵陈蒿汤的利湿机理探索，茵陈蒿汤治疗7天后，治疗组A组、治疗组B组的小鼠饮水饮食量均出现不同程度的增加，粪便色褐质软硬适中，排便时粪便不伴有拖尾排不尽现象，提示了茵陈蒿汤能改善食少纳呆、不欲饮、便溏软等湿热证的症状体征;研究结果显示，相比盐水组A组、盐水组B组，治疗组A组、治疗组B组结肠组织AQP3mRNA转录水平出现了不同程度的下调，治疗组A组、治疗组B组结肠组织AQP8mRNA转录水平出现了不同程度的上调，提示茵陈蒿汤能调节水通道蛋白的表达量，茵陈蒿汤的利湿作用的机制之一是作用于结肠组织通过下调AQP3表达量和上调AQP8的表达量实现。
　　盐水组A组、B组分别是模型A组、B组在自然发展状态下7天的表现。相比模型A组、B组，盐水组A组、B组TLR4mRNA、CD14 mRNA转录水平均出现不同程度的上调，提示温病湿热证TLR4通路的激活状态随着时间的进展程度加重;盐水组A组、B组AQP3mRNA转录水平均出现不同程度的上调，盐水组A组、B组的AQP8mRNA转录水平出现特异性，盐水组A组出现AQP8mRNA转录水平上升，盐水组B组出现AQP8mRNA转录水平下降，提示可能温病湿热证水湿内停的病理状态的加重与AQP3、AQP8的表达改变有相关性。
　　结论:
　　两种岭南特色温病湿热证小鼠模型造模成功，表现出相应的温病湿热证症状体征。温病湿热证存在肠道菌群的失调状态，湿热证出现大肠杆菌属、肠球菌属、梭菌属等条件致病菌过度增长，而双歧杆菌属、乳杆菌属等益生菌的含量受湿热发病机制的影响出现含量表达的差异，可能致病菌的过度增殖是温病湿热证实质的病理机制之一。温病湿热证的实质存在TLR4受体通路的激活和AQP3、AQP8表达的紊乱。茵陈蒿汤具有治疗温病湿热证的作用，茵陈蒿汤的清热利湿机制是通过抑制TLR4受体通路的激活达到清热效果和通过调节AQP3、AQP8的表达量来达到利湿效果。

目录

声明

摘要

引言

第1章 文献研究

1．1 湿热证研究发展

1．1．1 温病湿热证概述

1．1．2 温病湿热证与免疫功能研究

1．1．3 温病湿热证与氧化应激关系的研究

1．1．4 温病湿热症与热休克蛋白关系的研究

1．1．5 温病湿热证与水通道蛋白关系的研究

1．2 肠道菌群研究

1．2．1 肠道微生态系统

1．2．2 肠道免疫系统

1．2．3 肠道菌群与中医证型相关性研究

1．3 温病湿热证动物模型研究

第2章 预实验模型B组脾虚因素造模灌胃番泻叶浓度的探索

2．2．3 药物的稀释

2．2．4 实验步骤

2．2．5 观察指标

2．2．6 统计学方法

2．3 实验结果

2．3．1 各组小鼠体质量的动态改变

2．3．2 一般情况观察

2．4 讨论

第3章 岭南温病湿热证小鼠模型造模及相关血清炎症因子检测

3．1 实验材料

3．1．1 动物

3．1．2 饲料

3．1．3 实验药物

3．1．4 实验试剂

3．1．5 实验仪器

3．2 实验方法

3．2．1 动物分组

3．2．2 LPS工作液的配置

3．2．3 造模方法

3．2．4 样本的采集

3．2．5 观察指标

3．2．6 检测指标

3．2．7 统计学方法

3．3 实验结果

3．3．1 一般情况观察

3．3．2 体温、体重的动态变化

3．3．3 饮食量的观察

3．3．4 HE染色观察

3．3．5 各组血清LPS、TNF_α含量比较

3．3．6 各组结肠匀浆液TNF-α含量比较

3．4 讨论

第4章 岭南温病湿热证小鼠模型肠道菌群检测

4．1 实验材料

4．1．1 动物

4．1．2 饲料

4．1．3 实验药物

4．1．4 实验试剂

4．1．5 实验仪器

4．2 实验方法

4．2．1 动物分组

4．2．2 LPS工作液的配置

4．2．3 造模方法

4．2．4 样本的采集

4．2．5 观察指标

4．2．6 检测指标

4．2．7 实时荧光相对定量PCR

4．2．8 统计学方法

4．3 实验结果

4．3．1 —般情况观察

4．3．2 相对定量PCR法检测肠道主要菌群相对含量比较

4．4 讨论

第5章 岭南温病湿热证小鼠模型结肠TLR4、CDl 4转录水平检测及茵陈蒿汤在温病湿热证的清热机理探索

5．1 实验材料

5．1．1 动物

5．1．2 饲料

5．1．3 实验药物

5．1．4 实验试剂

5．1．5 实验仪器

5．1．6 实验药物配制

5．1．7 动物药物剂量的计算

5．2．4 取材组织的保存

5．2．5 RNA提取

5．2．8 实时荧光相对定量PCR

5．3．1 —般情况观察

5．3．2 3种引物的熔解曲线

5．3．3 3种引物的扩增效率计算

5．3．4 目的基因相对定量结果

5．3．5 茵陈蒿汤对各组小鼠模型血清TNF_α含量变化

5．4 讨论

第6章 岭南温病湿热证小鼠模型结肠AQP3、AQP8转录水平检测及茵陈蒿汤对温病湿热证的利湿机理探索

6．1 实验材料

6．1．1 动物

6．1．2 饲料

6．1．3 实验药物

6．1．4 实验试剂

6．1．5 实验仪器

6．1．6 实验药物配制

6．1．7 动物药物剂量的计算

6．2．7 RNA逆转录

6．2．8 实时荧光相对定量PCR

6．2．9 统计学方法

6．3 实验结果

6．3．1 —般情况观察

6．3．3 3种引物的扩增效率计算

6．3．4 目的基因相对定量结果

6．4 讨论

结语

参考文献

附录

致谢