茵栀黄注射液基于FXR通路治疗肝内胆汁淤积的机制研究

摘要

研究背景:
　　肝内胆汁淤积属于“黄疸”，临床上阳黄证较为常见。疏肝利胆退黄法为辨病论治的基本治疗法则，茵陈蒿汤为治疗阳黄的代表性方剂，茵栀黄注射液源于茵陈蒿汤。肝内胆汁淤积的发病率高，国内外诊断标准不统一，UDCA、SAMe、甘草酸类制剂是治疗IHC的一线药物，UDCA作用机制尚不明确，SAMe长期临床疗效和作用机制还有待进一步研究，经济效应也有待考虑。目前主流研究认为胆汁酸代谢的主要通路是FXR通路，FXR通路调控的成熟方法是利用GW4064和siRNA调控。目前关于茵栀黄注射液治疗黄疸的研究大多将FXR及下游基因等膜转运体作为同一层次的指标，忽略了FXR是上游受体，BSEP、MDR3、MRP2、OATP2是下游靶基因的关系，对这两个层次的相关性中医药研究不多。
　　目的:
　　通过研究疏肝利胆退黄法的代表药性药物茵栀黄注射液对HL-7702的FXR、BSEP、MDR3、MRP2、OATP2基因表达的影响，探讨茵栀黄注射液治疗肝内胆汁淤积的作用机制。
　　方法:
　　采用CCK8法探索不同浓度的YZH对HL-7702的活性影响，评价药物对细胞的毒性作用，确定最佳YZH干预的最佳浓度和最佳作用时间;用GW4064和siRNA调控FXR基因的表达，采用反转录实时荧光定量PCR法，2-ΔΔCt法研究目的基因mRNA的相对表达量;采用蛋白质免疫印迹法研究目的基因蛋白质的相对表达量;采用免疫荧光法对FXR、BSEP、MRP2蛋白定位和定性研究。
　　结果:
　　研究结果表明YZH对HL-7702的理想干预浓度1.08％(95％置信区间:0.89％～1.30％)，理想干预时间为15.47h(95％置信区间:12.92～18.54)。研究结果表明YZH对HL-7702活性的抑制作用与剂量正相关。YZH促进FXR基因的表达(P＜0.01); YZH促进MDR3基因的表达(P＜0.01); YZH抑制OATP2基因的表达(P＜0.01)。0.6％YZH促进BSEP基因的表达(P＜0.05)，1.2％YZH抑制BSEP基因的表达(P＜0.01);未下调FXR基因时，YZH抑制MRP2基因的表达。下调FXR基因后，YZH促进MRP2基因的表达(P＜0.01)。
　　结论:
　　肝内胆汁淤积属于“黄疸”，临床上阳黄证较为常见。疏肝利胆退黄法为辨病论治的基本治疗法则，茵陈蒿汤为治疗阳黄的代表性方剂，茵栀黄注射液源于茵陈蒿汤。YZH对HL-7702的理想干预浓度为1.08％，理想干预时间为15.47h，YZH对HL-7702活性的抑制作用与剂量正相关;YZH促进FXR基因的表达;YZH通过FXR基因调控MDR3基因的表达;YZH抑制OATP2、BSEP基因的表达;YZH对MRP2基因的表达为双向调控作用，其具体机制还有待深入研究。疏肝利胆退黄法的作用靶点为FXR，通过FXR通路调控胆汁酸代谢，从而治疗肝内胆汁淤积。

目录

声明

摘要

引言

第一章 文献研究

第一节 肝内胆汁淤积现代医学研究

一、流行病学

二、病因研究

三、发病机制

四、临床表现及诊断

五、治疗

第二节 中医文献研究

一、黄疸的发展历程

二、病因病机

三、病位

四、辨证分型

五、治法方药

第三节 茵栀黄注射液关于肝内胆汁淤积症的机制研究

一、茵栀黄注射液的现代研究

二、胆汁酸基于FXR的代谢及调控机制

三、茵栀黄注射液基于FXR调控胆汁酸代谢

第四节 研究问题及展望

一、茵栀黄注射液治疗肝内胆汁淤积的机理尚不完善

二、临床应用机理尚不明确

第二章 实验研究

第一节 实验材料及仪器

一、细胞株

二、实验材料

三、实验仪器

第二节 实验分组

一、YZH药效学研究分组

二、GW4064药效研究分组

三、YZH作用机制研究分组

第三节 实验方法

实验方法总论

实验方法各论

第四节 实验结果

一、细胞培养实验结果

二、不同浓度YZH干预不同时间细胞形态学变化实验结果

三、细胞增殖-毒性检测实验结果

四、FXR mRNA表达结果

五、FXR下游基因BSEP、MDR3、MRP2、OATP2引物检测及mRNA表达实验结果

六、siRNA转染实验结果

七、Western-blot检测FXR及下游基因的蛋白相对表达量的影响

八、免疫荧光实验对FXR及下游靶基因蛋白的定性和定位分析实验结果

第五节 结论与讨论

结语

参考文献

附录

研究生在学期间发表论文情况

致谢