心型脂肪酸结合蛋白单克隆抗体的制备及应用

摘要

心型脂肪酸结合蛋白(Heart Fatty Acid-binding Protein，H-FABP)是一种在心肌细胞中含量丰富的小分子量心肌可溶性蛋白，由于其分子量小的特点，在心肌受损后，2～3小时血清浓度即开始上升。检测病人血清中的H-FABP含量从而能确定心梗的发生。每年全球因心血管疾病死亡的人数占全球死亡人数的1/3。而在心梗发生6小时内实施再灌注治疗，则死亡率降低到1％之内，为此早期诊断AMI有着十分重要的意义。而H-FABP作为一种早期的AMI心肌标志物就同样具有着重要的研究意义。
　　本文通过重组H-FABP蛋白免疫BALB/c小鼠，取其脾脏的B细胞与骨髓瘤细胞SP2/0融合。经过亚克隆筛选出3株高效价的细胞株，分别命名为2C06、2F08、6G03。将三株杂交瘤细胞接种于BALB/c小鼠内大规模制备单克隆抗体。采用Protein G亲和柱纯化抗体后，经鉴定3株单克隆抗体均为IgG类，效价均达到1∶106以上，亲和力达到108以上。同时特异性检测和Western blot均表明3株抗体有较好的特异性。采用双抗体夹心ELISA配对抗体，筛选出以6G03为包被抗体与2F08为标记抗体配对能检测出H-FABP抗原，用这对抗体建立了酶联免疫分析方法和胶体金免疫层析法。
　　通过优化条件，建立的酶联免疫分析方法的检测范围为0 ng·mL-1～200 ng·mL-1，标准曲线的R2为0.9935，有较好的线性相关性。通过检测临床样本测定出正常人群血清中的H-FABP平均含量为2.6621±0.1321 ng·mL-1、AMI患者H-FABP平均含量为22.4897±1.8217 ng·mL-1，P＜0.05，表明正常人血清中H-FABP含量与AMI患者血清中H-FABP含量有着显著性差异。建立的胶体金免疫层析法的最低检出浓度为10 ng·mL-1，通过检测131例临床样本，与临床结果对照，敏感度为86.96％，特异度为97.65％，Kappa值为0.8633，一致性检测表明胶体金试纸条检测结果与临床确诊结果无显著性差异。所以建立的酶联免疫分析法和胶体金免疫层析法都适合H-FABP的检测。H-FABP单克隆抗体的制备以及免疫分析方法的建立为国内AMI早期诊断试剂盒的研发奠定了良好的基础。进一步研发更优秀的免疫分析方法检测H-FABP试剂盒，将会明显的改善我国检测H-FABP依赖进口的现状，明显降低医疗成本。

目录

摘要

第一章 绪论

1．1 FABP概述

1．1．1 FABP的特性

1．1．2 FABP的结构特点

1．1．3 FABP的生物学功能

1．2 FABP的临床应用

1．2．1 用于AMI的早期特异性诊断

1．2．2 用于梗塞面积的早期估计

1．2．3 用于监测AMI的复发

1．3 H-FABP分析检测方法研究进展

1．3．1 放射免疫法

1．3．2 酶联免疫吸附法

1．3．3 免疫比浊法

1．3．4 胶体金层析法

1．4 免疫分析测试技术介绍

1．4．1 基本定义

1．4．2 免疫分析方法研究进展

1．5 课题研究的目的及其意义

1．6 本课题的研究思路及内容

1．7 课题来源

第二章 H-FABP单克隆抗体的制备

2．1 前言

2．2 材料与试剂

2．2．1 动物与细胞

2．2．2 主要试剂和材料

2．2．3 实验仪器

2．2．4 溶液配制

2．3 实验方法

2．3．1 动物免疫

2．3．2 免疫血清效价测定

2．3．3 制备杂交瘤细胞

2．3．4 杂交瘤的筛选及亚克隆

2．3．5 单克隆抗体的大规模制备

2．3．6 单克隆抗体的纯化

2．3．7 H-FABP单克隆抗体的性质鉴定

2．4 实验结果

2．4．1 免疫血清效价测定

2．4．2 杂交瘤细胞的观察和筛选

2．4．3 腹水纯化后抗体的含量

2．4．4 SDS-PAGE电泳测定抗体纯度

2．4．5 腹水纯化后效价测定

2．4．6 抗体亚型的测定

2．4．7 抗体亲和力常数的测定

2．4．8 抗体的特异性结果

2．4．9 Western blot测定抗体结果

2．5 本章小结

第三章 H-FABP单克隆抗体的免疫分析方法的建立

3．1 前言

3．2 仪器与试剂

3．2．1 试剂与材料

3．2．2 仪器与设备

3．3 实验方法

3．3．1 酶联免疫分析法的建立

3．3．2 胶体金免疫层析法的建立

3．4 结果与分析

3．4．1 酶联免疫分析法测定H-FABP

3．4．2 胶体金免疫层析法测定H-FABP

3．5 本章小结

第四章 H-FABP单克隆抗体免疫分析方法的应用

4．1 前言

4．2 实验材料

4．3 实验方法

4．3．1 样本血清的收集

4．3．2 H-FABP抗体的制备、纯化以及鉴定

4．3．3 H-FABP的检测

4．3．4 实验结果

4．4 本章小结

结论与展望

参考文献

攻读硕士期间发表的论文

声明

致谢