新型抑制Tau蛋白聚合和稳定微管蛋白的双功能分子设计与合成

摘要

阿尔茨海默病(AD)是一种神经退行性疾病，在老年人当中时普遍存在的，这种疾病严重威胁人们的生活与健康。最新的研究表明，65岁以上人口的13％有遭受这种疾病的困恼，这也是在这个年龄段死亡的第五大病因。针对AD的病理机制目前主要有3种假说:淀粉样蛋白沉积、神经元纤维缠结(neurofibrillary tangles，NFTs)以及胆碱能神经元退行性病变。过去十几年里，抗AD药物的研究大都集中在Aβ级联假说相关的策略上。但最近，以Aβ为靶点的部分药物在三期临床试验中却以失败告终，因而“神经元纤维缠结”在AD病中的重要作用被人们广泛认可。
　　越来越多的研究表明，Tau蛋白在AD进程中发挥关键性的作用，Tau的异常修饰，尤其Tau蛋白水平及其磷酸化导致Tau成为毒性分子而聚积成PHF，从而发生神经元纤维变性，并对线粒体功能产生影响。以Tau蛋白为靶点治疗阿尔茨海默氏病的研究目前尚处在初级阶段，绝大多数药物小分子还处在理论设计阶段，只有一小部分进入二期临床试验。另一方面，Tau蛋白是一种微管相关蛋白，Tau蛋白的过度磷酸化导致聚合会严重影响微管蛋白的稳定性。因而，使用微管蛋白的稳定剂能够代偿Tau蛋白功能的缺失，调节微管的动态稳定性，使其恢复正常的介导轴突运输的功能，从而保护神经细胞而达到治疗阿茨海默症的目的。目前这类微管蛋白的稳定剂对AD的治疗作用已经在动物实验上得到了证实。
　　因此，本论文设计合成了一系列1-苯基吡咯烷-2,5-二酮衍生物，它们既对Tau蛋白聚合具有抑制作用，又对微管蛋白起稳定作用，将可能更有效地治疗阿茨海默症。本论文采用的方法是常规的有机合成、波谱解析、体外抑制Tau蛋白聚合活性以及微管蛋白稳定性测试等，以1-苯基吡咯烷-2,5-二酮为基础，设计合成了三个系列苯基吡咯烷酮类衍生物（共计近20个产物，所合成的化合物结构新颖，未见文献报道）。
　　微管蛋白提取，根据微管蛋白在低温下解聚而在常温下(37℃)聚合的特点，使用超高速离心机，一步步的将微管蛋白提纯出来，并用蛋白质电泳法检测微管蛋白的纯度，从纯度分析表明，所提纯的微管蛋白纯度较好，可以进行测试时的使用。
　　活性测试结果表明，所合成的化合物具有优于亚甲基蓝对于Tau蛋白聚合的抑制性同时，也具有稳定微管蛋白的作用，优于阳性对照组紫杉醇的对微管蛋白的稳定性。特别是系列Ⅲ化合物的12a2,既对微管蛋白有较好稳定活性，同时对Tau蛋白的聚集有显著的抑制作用。因此，具有作为抗阿尔茨海默症候选药物的潜在可能性。

目录

摘要

第一章 绪论

1．1 阿尔茨海默症的发病机理

1．2 Tau蛋白假说

1．2．1 Tau蛋白的结构及其功能

1．2．2 Tau蛋白磷酸化与神经毒性

1．2．3 Tau蛋白磷酸化形成在AD发病中的作用

1．2．4 微管假说

1．2．5 以Tau蛋白为靶点的治疗AD症药物的现状及研究进展

1．2．6 Tau蛋白聚集抑制剂

1．3 微管

1．3．1 Tau蛋白与微管

1．3．2 以微管蛋白为靶点的治疗AD症药物的现状及研究进展

1．4 本课题的研究内容与意义

1．4．1 研究内容

1．4．2 本课题的研究意义

1．5 本章小节

第二章 化合物的设计与合成

2．1 含1-苯基吡略烷-2，5-二酮衍生物设计与合成

2．2．含饶丹宁分子基团的双靶点分子的设计与合成

2．3．含亚甲基蓝分子基团的双靶点分子的设计与合成

2．4 试剂的处理与化合物的合成

2．4．1 实验试剂和仪器

2．4．2 实验仪器

2．4．3 试剂的处理

2．4．4．催化剂DPPOx的合成

2．4．5 化合物1的合成

2．4．6 化合物4的合成

2．4．7．中间体化合物5的合成

2．4．8．化合物9、10的合成

2．4．9．化合物12的合成

第三章 从猪脑中提取微管蛋白

3．1 材料的准备

3．2 磷酸纤维素层析柱准备

3．2．1 磷酸纤维素树脂活化

3．2．2 装柱

3．3 微管蛋白的准备

3．3．1 猪脑前处理

3．3．2 均质化脑组织

3．3．3 分离微管蛋白

3．4 纯化微管蛋白

3．5 载入微管蛋白

3．6 从变性微管中分离微管蛋白

3．7 微管蛋白纯度的测定

第四章 化合物的体外生物活性检测

4．1 体外微管蛋白稳定性测试

4．1．1 实验原理及方法

4．2 体外Tau蛋白聚合抑制活性的硫磺素-S(ThS)测试

4．2．1 实验原理及方法

4．3 测试结果及分析

4．3．1 系列化合物Ⅰ的测试结果

4．3．2 系列化合物Ⅱ的测试结果

4．3．3 系列化合物Ⅲ的测试结果

4．4 本章小结

结论与展望

参考文献

附图

攻读硕士期间发表的论文及申请专利

声明

致谢