关节镜监视下hBMP-2基因转染骨髓间充质干细胞植入治疗股骨头缺血性坏死的实验研究

摘要

关节镜监视下hBMP-2基因转染骨髓间充质干细胞治疗股骨头缺血性坏死骨髓基质系统中含有非造血组织的干细胞，因其能分化为骨、软骨、脂肪、肌肉、肌腱、骨髓基质等多种间充质组织的细胞而统称为间充质干细胞(Mesenchymal stem cells，MSCs)或骨髓基质干细胞(Bone marrow stromal stem cells，BMSCs)。对股骨头缺血性坏死、骨组织工程学的研究表明，骨髓间充质干细胞不仅充当骨生成细胞的来源，而且可作为基因治疗技术适宜的细胞载体。 股骨头缺血性坏死的修复与重建是骨科常见的难题，临床亟需能够有效促进股骨头修复的新方法。对骨发生和修复的研究证实，成骨细胞的形成与成骨能力的增强是骨形成的关键环节，BMP-2(Bone Morphogenetic Protein-2)是其中关键的骨形成因子，不仅可以促进成骨细胞的再生、迁移、聚集，并且介导成骨细胞、软骨细胞、破骨细胞、破软骨细胞的分化及功能。因此，BMP一2促进成骨能力可望成为骨科疾病临床治疗的新途径。然而，直接将BMP-2应用于股骨头坏死处易被周围组织中的酶类所降解，作用时间短。基因治疗能克服上述缺点，近年来应用BMP-2基因治疗骨缺损等各种骨科疾病成为国内外研究的热点，并已开始进行临床试验。本研究拟以兔MSCs为细胞模型，阐明体内外培养兔MSCs的生长特性及其成骨潜能，构建rAAV-2-hBMP-2转染的兔MSCs复合物，探讨其在修复兔股骨头缺血性坏死中的作用，为股骨头缺血性坏死的组织工程治疗提供实验基础。 目的：探讨hBMP-2转染的骨髓间充质干细胞的生物学特性，及其在体外培养中的成骨能力。研究髓芯减压关节镜监视下hBMP-2基因转染骨髓间充质干细胞在治疗股骨头缺血性坏死中的作用及价值。 方法：在无菌条件、戊巴比妥钠麻醉(30mg/Kg)下，双侧股骨外侧髁和胫骨近端穿刺获取成年新西兰白兔(6月龄，体重2.5-3.0Kg)骨髓，采用密度梯度离心方法分离兔骨髓间充质干细胞并大量扩增，加入10 ml的1640(含10％的胎牛血清)进行培养。倒置显微镜下观察细胞形态和生长情况，钙结节染色、碱性磷酸酶染色检测骨髓间充质干细胞的成骨能力。研究兔骨髓间充质干细胞的成骨潜能。制备rAAV-2-hBMP-2，以腺相关病毒介导hBMP-2转染兔骨髓间充质干细胞，在细胞90％汇合后行病毒转染过夜，感染被率(MOI)为100，每瓶约加1∶2稀释的病毒液约4ml，换液后继续培养。收获转染后24h至6d的转染上清，应用Westernblot检测转染MSCs中辛外源hBMP-2基因的转录与表达。36只新西兰白兔建立液氮即刻冷冻股骨头缺血性坏死模型，根据不同移植物随机分为3组，每组12只，A组为空白骨坏死对照组，B组为髓芯减压并MSCs组，C组髓芯减压并hBMP-2转染MSCs组。关节镜监视并对坏死骨清除后植入骨髓间充质干细胞，术后4周和8周对股骨头行组织学检查。 结果：原代培养中，第4天首次换液，成纤维细胞样细胞贴壁于培养瓶底，并有少数克隆形成，即来源于成纤维细胞克隆形成单位(Colony-forming unit-fibroblasts,CFLJ-Fs)。第7-10天期间，克隆逐渐增多、增大，形成直径5mm-8mm的较大克隆和(5mm的小克隆。随着培养时间的延长钙结节逐渐增多，细胞间出现致密圆形不透光团块，经von Kossa染色呈现片状的棕染，着色区域范围广、面积大；大部分碱性磷酸酶染色的骨髓间充质干细胞呈阳性反应。hBMP-2基因转染的兔骨髓间充质干细胞可有效表达hBMP-2，其分泌于培养上清中的蛋白产物有促进兔成骨细胞增值及增加成骨细胞活性的作用。组织形态学检测发现植入后4周c组有明显成骨，8周时坏死区被完全修复：B组只有较少新骨形成，8周时坏死区仍多为纤维组织。C组新骨体积明显大于B组。造模后8周A组股骨头塌陷：植入后8周B组股骨头存在囊状密度减低区：C组股骨头形态规则，无塌陷。 结论：体外培养的兔骨髓间充质干细胞是具有成克隆性、自我更新能力的成纤维样细胞；hBMP-2基因转染的兔骨髓间充质干细胞可有效表达具有生物活性的hBMP-2蛋白，对以hBMP-2基因和骨髓间充质干细胞为基础的基因治疗在股骨头缺血性坏死修复与再造的应用中提供了实验基础。通过关节镜监视可以彻底清除死骨，使hBMP-2基因修饰的骨髓间充质干细胞准确的回植入股骨头坏死处，可使股骨头缺血性坏死的修复加强，对股骨头缺血性坏死的治疗意义较大。

目录

论文说明：英文缩略词简表

前言

一 材料与方法

二 结果

三 讨论

四 结论

参考文献

综述 股骨头缺血性坏死的基因治疗研究进展

致谢