微阵列分析龋易感儿童患龋前后牙菌斑生物膜微生物组成多样性

摘要

龋病是一种危害人类健康的重要口腔常见病，对龋病发生的始动因子——牙菌斑生物膜特性的研究一直是口腔医学界关注的焦点。龋病发生在牙菌斑微生态与牙体硬组织表面组成的微环境中，最新的菌斑生态学说认为，牙菌斑中细菌是人类口腔正常的微生物群，正常情况下菌丛间的组成处于动态平衡，当这一平衡受到干扰时，正常的口腔微生态失调，大量具有致龋潜力的产酸耐酸菌数量显著增多或毒力增强，非致龋性菌斑就会向致龋性菌斑转变，产生大量致病物质，导致龋病的发生。口腔中有700多种细菌，一半以上尚未能培养，而对于口腔微生物群落组成多样性的研究，多局限于主要的几种已知致病菌，尚缺乏对菌斑生物膜致龋机理的全面和整体认识。
　　 目的：本研究使用人类口腔微生物芯片(THe Human Oral Microbe Identification Microarray，HOMIM)从种、系、型水平对龋敏感儿童患龋前后相同部位牙菌斑微生物细菌群类进行检测；比较患龋前后牙菌斑微生物的定植情况及数量的多样性改变，以全面认识菌斑微生物与龋病发生的关系。
　　 方法：牙菌斑样本分别取自20个龋易感儿童患龋前后第一恒磨牙，提取混合菌斑总DNA，进行16S rRNA特异性序列片段PCR扩增，产物经荧光素Cy3-dCTP标记后与基于16SrRNA寡核苷酸探针所制备的HOMIM杂交，专用软件处理数据，使用聚类分析、两相关样本秩和检验及配对卡方检验等进行统计学分析。
　　 结果：20个受试者患龋前后第一恒磨牙牙菌斑中共检测到107个细菌种或种系型，分别归属于7个门类，23个属类，患龋前后每一个样本细菌种或种系型数量范围，患龋前从50至87、牙菌斑中微生物的种系型数量为66.5(中位数、Median)；患龋后从45至77，牙菌斑中微生物的种系型数量为60(中位数、Median)，患龋前细菌群类多样性高于患龋后(P<0.05)。患龋前后细菌检出率的比较：患龋前拟杆菌(Bacteroidessp)、麻疹孪生球菌(G.morbillorum I_K64)、口金氏菌(K.oralis)、脱氮金氏菌(Kingelladenitrificans I_W30)、砂真杆菌(E.saburreum I_W21)、弯曲杆菌(Campylobactercl I_T87)、奈瑟氏菌(Neissera cl V_Y58)、生痰二氧化碳纤维菌(Capnotophagespntigena I_w46)、嵴链球菌(S.cristatus)、轻链球菌(S.mitis biovar II)的检出率高于患龋后，除轻缓链球菌、嵴链球菌(P>0.05)外，其余各菌差异均有统计学意义(P<0.05)；患龋后变异链球菌(S.muantas)、戈氏放线菌(A.gerensceriae I_E46)、月形单胞菌(SelenomanasEW084)、栖牙普雷沃菌(Prevotella denticola K73)、咽峡炎链球菌(S.anginosus intermedius II_AB82)、中间链球菌(S.intermedius_constellatus II AB77)、远缘链球菌(S.sobrinus)、内氏放线菌2型(A.naeslundii II AC71)、溶牙放线菌(A.odontolyticus I_X03)、具核梭杆菌(Fusobacterium nucleatum)检出率均高于患龋前，除远缘链球菌、内氏放线菌2型、溶牙放线菌、具核梭杆菌(P>0.05)外，其余各菌差异均有统计学意义(P<0.05)；血链球菌(Streptococcus sanguinis I_AB75、Streptococcussanguinis II_AB78)，奈瑟氏菌(Neisseria)、口腔链球菌(S.oralis)、昭和弯曲杆菌(Campylobacter showae)患龋前数量高于患龋后(P<0.05)：而患龋前后变异链球菌的数量较少，但与韦荣菌属(Veillonella)、戈氏放线菌(A.gerensceriae I E46)、纤维弯曲杆菌(Campylobacter gracilis)相同，其数量高于龋病发生前(P<0.05)。
　　 结论：
　　 1.龋病发生前牙菌斑微生物群类多样性高于龋病发生后；
　　 2.乳杆菌可能不是龋病发生的初始致龋菌；
　　 3.虽然变异链球菌在患龋后的检出率及数量均高于患龋前，但与其它存在于牙菌斑中的优势菌(如韦荣菌、放线菌、普氏菌及其它口腔链球菌等)比较其数量较低，变异链球菌在龋病发生过程中的主导地位仍需综合其毒力因子全面考虑。50％的个体没有检测到变异链球菌，表明牙菌斑中的产酸并不仅仅依赖于变异链球菌，牙菌斑中多种细菌的协同作用才是龋病发生的最终机制；
　　 4.虽然流行病学认为表兄链球菌在龋病发生过程中起到重要的角色，但在我们的实验中其检出率及数量较低，并不是主要的致龋菌；
　　 5.放线菌属、韦荣氏菌、普氏菌在龋病发生过程中占重要的角色，这与先前国外的报道一致；
　　 6.奈瑟氏菌在龋病的发生发展过程中具有降低菌斑致龋力的作用：
　　 7.血链球菌为维持生态平衡的重要细菌，其数量的减少导致菌斑微生态失衡间接引起龋病的发生。
　　 8.口腔链球菌可能会促进其他主要致龋菌的粘附与定植；
　　 9.咽峡炎链球菌组为龋病发生的条件致病菌；
　　 10.拟杆菌、麻疹孪生球菌、口金氏菌、脱氮金氏菌、砂真杆菌、生痰二氧化碳纤维菌主要存在于龋病发生前的牙菌斑中，认为其与龋病的发生呈负相关关系。
　　 以上这些研究发现支持菌斑微生态学说，当龋病发生后局部微环境的改变将导致牙菌斑中菌群组成的变化。
　　 本课题首次纵向研究了高龋儿童龋病发生前后牙菌斑中微生物种类和数量结构的变迁，对多种龋相关细菌进行了较为深入的分析，进一步认识了变异链球菌、放线菌、普氏沃氏菌菌、韦荣氏菌、奈瑟氏菌等在龋病发生中的作用，证实了牙菌斑生物膜中微生物结构的复杂性和多样性、多种细菌的综合作用是龋病发生的重要机制，从全局和整体客观认识菌斑生物膜微生物与龋病发生的关系，将为龋病微生物病因学研究和龋病的防治提供重要的实验基础和理论依据。

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综述 白色假丝酵母菌与龋病的相关性研究

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