人胰岛素原基因的克隆以及在大肠杆菌中的高效表达、质谱鉴定

摘要

随着糖尿病人的不断增多，人胰岛素做为最主要的治疗药物，其需求量越来越大。同时，做为糖尿病病因检查的人胰岛素检测试剂盒的需求也越来越广泛。重组人胰岛素是第一个批准的转基因药物，修饰重组胰岛素因其更为优越的治疗效果而在逐步占领糖尿病治疗市场。通过基因工程手段生产的重组人胰岛素主要以含人胰岛素原基因的大肠杆菌发酵得到。真核基因在大肠杆菌系统直接表达时往往产率较低，由此造成生产成本增加。本文以前期设计、合成的适合在大肠杆菌表达系统中表达的人胰岛素原基因为材料，亚克隆该基因至表达载体pGEX-3X和pET-32a，分析了该基因在E.coli中的适宜表达条件，获得了可高效表达人胰岛素原的工程菌株和培养条件。
　　本研究主要内容包括：⑴使用限制性内切酶BamHI和EcoRI酶切重组质粒 pBluscript-hPINS，分离人胰岛素原基因片段，该片段的长度为275bp。将人胰岛素原基因亚克隆至表达载体 pGEX-3X，经 DNA序列测序核实获得的重组表达载体pGEX-Ins。该重组表达载体的大小为5227bp，所编码的重组融合蛋白大小为35kDa。⑵重组表达载体pGEX-Ins转化表达菌株E.coliBL21（DE3）和E. coliBL21 star(DE3)，构成表达重组蛋白的稳定菌株。从表达菌株、生长温度、诱导温度、诱导剂浓度和诱导时间五个方面优化其表达条件，最终确定重组人胰岛素原蛋白的适宜条件为：表达菌株E. coliBL21 star(DE3)、大肠杆菌的生长温度30℃、诱导时的细菌密度OD550≧0.5、诱导温度为26℃、诱导剂IPTG的浓度为2mmol/L。大量表达重组人胰岛素原蛋白，收集菌体，超声破碎细胞，SDS-PAGE分析上述条件表达的重组蛋白主要以包涵体的形式存在。提取和纯化包涵体后，重组蛋白占包涵体蛋白的80.5％。重组蛋白的得率为38.8mg/L。重组蛋白经串联质谱鉴定后结果显示GST被诱导表达，而GST之后的人胰岛素原被一未知多肽替换，碱基序列再次测定后并未发现移码突变和碱基突变，其序列的基因顺序和起始重组质粒pGEX-Ins完全一致。⑶以重组载体pGEX-Ins为模板，PCR扩增人胰岛素原基因，扩增产物大小约为273bp。回收扩增产物后亚克隆至表达载体 pET-32a，构建表达载体 pET-Ins。该重组表达载体的大小为6173bp，所编码的重组蛋白大小为28kDa。⑷重组表达载体pET-Ins转化大肠杆菌E.coli BL21（DE3），含重组蛋白的菌株，从生长温度、诱导温度、诱导剂浓度和诱导时间四个方面优化其表达条件。重组人胰岛素原基因的适宜表达条件为：大肠杆菌的生长温度30℃、诱导时的细菌密度OD550≧0.5、诱导生长温度为26℃、诱导剂IPTG的浓度为1mmol/L。大量表达重组人胰岛素原蛋白，收集菌体，超声破碎菌体细胞，SDS-PAGE分析表达重组蛋白主要以包涵体的形式存在。提取和纯化包涵体后，重组蛋白占包涵体总蛋白的89.9%。重组蛋白条带经串联质谱鉴定，结果显示该重组蛋白含有人胰岛素原。⑸将人胰岛素原基因克隆至pGEX-3X的GST标签蛋白之后BamHI和EcoRI位点，通过双酶切鉴定和测序鉴定，确定表达载体pGEX-Ins序列的准确性。将表达载体转化入大肠杆菌获得稳定表达目的蛋白的菌株。通过诱导该基因在大肠杆菌中高效表达，进而分离纯化得到重组人胰岛素原蛋白。该蛋白经串联质谱鉴定后发现 GST之后的目的蛋白被一未知多肽所代替。对表达载体重新测序鉴定后发现基因序列并未发生移码突变或碱基突变，其原因还需要进一步的研究。将人胰岛素原基因扩增后亚克隆至pET-32a的BamHI和EcoRI位点，通过双酶切鉴定和测序鉴定，确定表达载体pET-Ins序列的准确性。将重组质粒pET-Ins转化入大肠杆菌中，获得高效预期大小的重组蛋白的菌株。分离纯化后的重组蛋白条带经串联质谱鉴定后确定为含有人胰岛素原的重组蛋白。

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英文缩写词表(Abbreviations)

第一章绪论

1.1 胰岛素简介

1.2 生产胰岛素表达系统的简介

1.3 蛋白质纯化

1.4 蛋白质鉴定的方法

1.5 本课题的研究目的、意义和前景

第二章 重组人胰岛素原基因表达载体pGEX-Ins的构建、表达、纯化以及质谱鉴定

2.1 材料

2.2 方法

2.3 结果

本章小结

第三章重组人胰岛素原表达载体pET-Ins的构建、诱导表达、纯化以及质谱鉴定

3.1 材料

3.2 方法

3.3 结果分析

本章小结

结论

参考文献

致谢

附录A：攻读学位期间所发表的学术论文目录

附录B：人胰岛素原的碱基序列