门冬胰岛素结晶工艺的研究

摘要

目的:
　　①对门冬胰岛素原料药生产过程中的蛋白结晶工艺进行研究,确定结晶的制备工艺,为生产提供成熟稳定的工艺路线。
　　②使门冬胰岛素成品以晶体的形式保存和运输,降低门冬胰岛素原料在储运过程中质量变化的风险,提高产品的稳定性,减少生产过程中的损失,为制剂提供稳定的原料药产品,保证为患者提供安全,有效的产品。
　　方法:
　　①蛋白结晶:室温(23℃)下,用注射用水配制含3.0~10.0 g/L门冬胰岛素的结晶液,加入结晶物质,使其含0.2~1.5 M甘氨酸、体积分数为10~30％的有机溶剂、体积分数为0.2~0.4%的酚类物质和0.2~0.5 M盐类物质,调节结晶液pH6.0~6.5,加入锌离子(锌离子与门冬胰岛素的摩尔比),室温下结晶3~6小时后降温至2~8℃,静置12~18 h后析出蛋白晶体。
　　②晶体与结晶液固液分离及洗涤:结晶后抽去结晶体系上清母液,加入等体积20%乙醇搅拌洗涤,静置一定时间后,抽去或倾倒出上清液,重复以上操作2-4次,最后将晶体冻干成粉末。
　　③按照药典稳定性试验标准对结晶粉进行影响因素试验和加速试验。
　　④参照中国药典2010年版二部附录Ⅶ G胰岛素生物测定法对门冬胰岛素进行生物活性测定。
　　结果:
　　①通过上述实验摸索出了一套门冬胰岛素原料药的结晶工艺条件参数,并成功得到蛋白晶体。
　　②通过显微镜观察,可见晶型均一性好,形状规则的晶体。通过超高效液相色谱仪(HPLC)检测,稳定性试验各项结果符合药典标准。
　　③门冬胰岛素生物活性为25单位/mg,符合中国药典规定的每1 mg的效价不得少于15单位/mg。
　　结论:
　　门冬胰岛素原料药的结晶工艺符合生产要求,本工艺减少原料药生产过程中的损失,提高蛋白的稳定性,推进门冬胰岛素原料药结晶的研究进展。

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前言

1 材料和方法

1.1 主要实验材料

1.2 主要设备和试剂

1.2.1 主要仪器和设备

1.2.2 主要试剂

1.3 实验方法

1.3.1 门冬胰岛素结晶体系的建立

1.3.2晶体固液分离

1.3.3门冬胰岛素稳定性试验

1.3.4 门冬胰岛素生物活性测定

2 结果

2.1门冬胰岛素结晶体系的建立

2.1.1门冬胰岛素结晶条件摸索实验结果

2.1.2 有机溶剂对结晶工艺的优化

2.1.3 氯化钠对结晶工艺的优化

2.1.4结晶条件组合实验

2.1.5甘氨酸体系对结晶工艺的优化

2.1.6 门冬胰岛素结晶放大实验

2.2晶体固液分离

2.2.1水洗洗涤方法

2.2.2固液分离方法

2.2.3门冬胰岛素蛋白纯度、含量、收率的测定

2.3门冬胰岛素稳定性试验结果

2.3.1影响因素试验结果

2.3.2加速试验结果

2.4门冬胰岛素生物活性测定结果

2.4.1测定小鼠血糖值

2.4.2门冬胰岛素效价

3 讨论

3.1门冬胰岛素结晶体系的建立

3.2门冬胰岛素晶体后固液分离

3.3门冬胰岛素晶体稳定性试验和生物活性测定

4 结论

参考文献

2种长效胰岛素类似物的研究进展