紫花苜蓿(Medicago sativa L.)抗镉品种金属硫蛋白基因差异显示分析

摘要

重金属镉(Cd)作为非必需微量元素，经根系吸收并累积时对植物具有很强的毒性，植物硫代谢、抗氧化系统和Cd2+跨膜运输是植物对重金属镉响应的主要途径，包括Cd2+诱导植物硫转运蛋白、硫还原相关酶类以及半胱氨酸、谷胱甘肽和植物螯合肽合成及其基因表达调控，进一步开展植物对Cd的响应途径及其调控机理和基因表达研究，对改良植物对Cd的耐受性以及开发Cd超累积植物具有重要意义。本研究利用水培系统对36份紫花苜蓿(Medicago sativa L.)种质材料进行抗镉性筛选试验，对获得的抗镉苜蓿品种进行CdCl2胁迫条件下的生理生化响应研究，并进一步利用mRNA差异显示分析方法克隆紫花苜蓿金属硫蛋白(metallothionein，MTs)基因MsMT2a和MsMT2b，结果如下： 1)选用0、5、10、15、20、25、50和100 mg/L的CdCl2浓度梯度进行抗镉性筛选研究，确定适宜的CdCl2筛选浓度为25 mg/L，进一步利用水培法对25 mg/LCdCl2处理和对照条件下的苜蓿幼苗进行培养，分析比较紫花苜蓿种质材料在胁迫处理和对照条件下根长、茎长、根生物量和茎生物量参数的变化发现，根相对生长量是适宜的衡量紫花苜蓿镉耐受性的参数。在此基础上综合考虑以上4个形态学指标，利用配对T检验进行显著性分析，筛选出2个镉抗性品种，即野苜蓿和陇中苜蓿。 2)对抗镉品种即野苜蓿和陇中苜蓿进行Cd胁迫处理(25 mg/L CdCl2)，研究胁迫处理和对照条件下镉离子(Cd2+)在紫花苜蓿植株体内的分布和积累情况、抗氧化系统和光合性能的变化，结果发现，在CdCl2胁迫处理8d的时候，野苜蓿和陇中苜蓿根中的Cd2+浓度分别达到1140和1122 mg kg-1，在茎中分别为94.8和89.5 mg kg-1，在叶中分别只有85.7和75.7 mg kg-1，表明抗镉苜蓿品种野苜蓿和陇中苜蓿对Cd2+的吸收累积主要发生在根部，Cd2+的向上转运能力较弱，在一定程度避免了Cd2+对叶片生理生化功能的破坏，从而表现出抗镉性。 抗镉品种野苜蓿和陇中苜蓿叶片中SOD、POD和CAT酶的活性随着CdCl2胁迫处理(25 mg/L CdCl2)时间的延长表现出不同的变化趋势，在遭受胁迫的前12 h POD酶活性急剧升高，之后POD酶活性平稳下降；CAT酶活性在镉处理后12h内缓慢下降，而在12-24 h内急剧上升，之后CAT酶活性缓慢下降；镉胁迫下SOD酶活性与CAT酶有着相似的变化趋势。以上结果表明紫花苜蓿开始遭受镉胁迫时，通过刺激过氧化物酶的活性来加强植物体对镉胁迫的耐受性，随着镉胁迫时间的延长，过氧化物酶活性的降低可能是由于重金属影响蛋白质结构的完整性造成的。 随着CdCl2胁迫时间的延长，野苜蓿和陇中苜蓿幼苗第五片叶的Fv/Fm值变化有相同的趋势，都随着镉胁迫时间的延长而缓慢下降，其中，CdCl2处理6、12、24和48h时的Fv/Fm值仅比对照分别减少1、3、3.5和4％，即25 mgL-1 Cd2+胁迫下两个苜蓿品种叶片的Fv/FM并没有显著降低，表明Cd2+胁迫对野苜蓿和陇中苜蓿光合系统的影响较小。 3)分别选取前人报道的金属硫蛋白基因(metallothionein)AsMT2a和AsMT2b的特异性引物(5'CATAATGAAATGAAACTA3'和5'CGGGGACAGATCATCA3'；5'AATAAACTAGCTGGAGTCTTTCTTC3'和5'ACGCGGGGACATCATCCATCTTC3')，对抗镉品种野苜蓿和陇中苜蓿进行紫花苜蓿金属硫蛋白基因mRNA差异显示分析，在2个紫花苜蓿品种对照和处理组中共克隆得到5条特异性条带，MsMT2a基因片段(M1-M4)大小为525bp，MsMT2b基因片段(M5)大小为510bp。M1、M2、M3和M4均与大蒜(Allium sativum)编码金属硫蛋白基因的同源性达到97-98％，与豆科植物红豆(Vigna angularis)、豌豆(Pisum sativum)和白三叶(Trifolium repens)中编码金属硫蛋白基因的同源性达到68-71％，所得结果与豆科植物中编码金属硫蛋白的基因也有较高的覆盖率。M5与大蒜(Allium sativum)编码金属硫蛋白基因的同源性达到98％，与豆科植物豌豆(Pisum sativum)和蚕豆(Vicia faba)中编码金属硫蛋白基因的同源性达到68-85％，所得结果与豆科植物中编码金属硫蛋白的基因也有较高的覆盖率。除此之外，MsMT2a和MsMT2b基因片段还与马铃薯(Solanum tuberosum)、凤眼莲(Eichhornia crassipes)、遏兰菜(Thlaspi caerulescens)、烟草(Nicotiana tabacum)、芸苔(Brassica juncea)、丹参(Salvia miltiorrhiza)和番茄(Lycopersicon esculentum)中编码金属硫蛋白基因具有较高的同源性。

目录

文摘

英文文摘

声明

前言

第一章文献综述

1 Cd在植物中的累积及其毒害作用

1.1 Cd2+在根中的累积及其生长抑制作用

1.2 Cd2+在叶中的累积及其生长抑制作用

1.3 Cd2+在细胞中的累积及其离子毒害作用

2植物对重金属Cd的响应途径及其调控机理

2.1 Cd2+胁迫下的植物抗氧化系统

2.2植物硫代谢对Cd22+胁迫的响应

2.3 Cd的跨膜运输及其调控

3本研究课题的提出

第二章紫花苜蓿抗镉品种的筛选

1引言

2材料与方法

2.1材料

2.2抗镉筛选试验

2.3数据统计分析

3结果和分析

3.1紫花苜蓿Cd2+筛选浓度确定

3.2抗镉紫花苜蓿品种筛选

4讨论

第三章 紫花苜蓿抗性品种对镉胁迫的生理响应

1引言

2材料与方法

2.1材料

2.2 CdCl2胁迫处理

2.3紫花苜蓿根、茎和叶中镉含量测定

2.4紫花苜蓿叶片抗氧化酶活性测定

2.5 MDA含量测定

2.6光合活性的测定

2.7叶绿素含量的测定

2.8数据分析

3结果

3.1抗镉苜蓿品种植株体内镉的吸收和累积

3.2 Cd2+对抗氧化酶活性的影响

3.3 Cd2+对膜质过氧化的影响

3.4 Cd2+对叶绿素含量的影响

3.5 Cd2+对叶绿素荧光的影响

4讨论

4.1抗镉苜蓿品种抗氧化酶系统对Cd2+胁迫的响应

4.2抗镉苜蓿品种光合系统对Cd2+胁迫的响应

第四章紫花苜蓿金属硫蛋白基因差异显示分析

1引言

2材料与方法

2.1材料

2.2 CdCl2胁迫处理

2.3植物总RNA的提取

2.4 cDNA第一链的合成

2.5苜蓿金属硫蛋白基因引物的确定

2.6目的条带的扩增与检测

2.7目的DNA片段的回收

2.8 PCR产物连接及转化

2.9阳性克隆的筛选

2.10质粒DNA的提取

2.11质粒DNA的PCR

2.12数据分析

3结果

3.1苜蓿抗性品种目的条带的检测

3.2目的条带的回收及其检测

3.3苜蓿MsMT2a和MsMT2b的克隆及其序列分析

4讨论

第五章结论

参考文献

硕士期间发表论文和项目资助情况

致谢