非洲爪蟾(Xenopus laevis)眼的形态发生以及转录因子Pax6在眼发育过程中的免疫组化研究

摘要

本文以两栖类模式实验动物非洲爪蟾(Xenopus laevis)为实验材料,运用组织切片和免疫组化技术观察了非洲爪蟾眼的形态发生和转录因子Pax6在眼发育过程中的表达模式,并运用Image-proplus6.0专业图像分析软件对其表达强度进行定量分析。组织形态发生及定量分析结果表明:视网膜色素上皮(Retina pigmentepithelum,RPE)在眼发育过程中经历了由厚-薄-厚-薄的变化,从胚胎发育20期到adult,部分相邻时期之间存在显著性差异(P<0.05)。神经视网膜(Neural retina,NR)从胚胎发育第20期到24期厚度呈递减趋势(相邻两期之间差异极显著,P<0.001):从26期到32期,34期到42期NR厚度经历了两次由薄-厚-薄的变化,34期与36期无显著性差异,其余相邻两期之间差异极显著(P<0.01)；44期至成体,NR厚度递增,44期与46期无显著性差异,48-adult相邻两期之间差异极显著(P<0.01)。免疫组化结果表明:在眼发育过程中,Pax6起始表达于整个视泡,随后Pax6的表达首先在RPE中降低并消失,胚胎发育至42期,Pax6仅表达在视网膜的内核层(INL)和神经节细胞层(G),而在晶状体和睫状体边缘区(CMZ)未检测到其表达。与前人研究结果不同的是,本实验观察到Pax6在外网层(OPL)和内网层(IPL)也有较明显的阳性反应,推测其可能与轴突生长和精确化定位有关。定量分析免疫组化的结果显示:胚胎发育至20期,Pax6的阳性表达达到峰值,此后Pax6的表达水平逐渐下降,然后从26-28期,30-38期阳性表达呈递增的趋势,,随后表达降低,44-50期阳性表达呈递增的趋势。Pax6在眼各个组织的精确表达的动态变化如下:在角膜发育中,从30-34期呈递减趋势,38期阳性反应较强,40期到46期递减;在晶状体发育中,从26-38期呈递增趋势,40期以后呈递减趋势;在视网膜发育中,从40-50期,它在外网层、外核层、内核层和内网层表达呈递增的趋势。以上结果初步验证了Pax6是一个剂量依赖性和位置依赖性的调控子,在眼睛发育的不同组织结构中扮演着不同的角色。以上研究结果为建立无尾两栖类眼发育的胚胎实验模型和深入探讨主控基因Pax6在眼发育过程中的作用机理奠定了良好的基础。

目录

文摘

英文文摘

一 前言

1 脊椎动物眼睛的基本结构

2 脊椎动物眼的早期形态发生概述

2.1 视网膜细胞分化的分子机制

2.2 脊椎动物视网膜色素上皮(RPE)的结构

2.3 RPE分化的分子机制

3 转录因子在眼发育中的作用

3.1 Pax6在眼发育中的作用

4 非洲爪蟾(Xenopus laevis)简介

4.1 生活习性

4.2 研究价值

4.3 生命周期

5 本文研究内容及意思

5.1 研究内容

5.2 研究意义

二 材料与方法

1 材料

2 方法

2.1 组织学切片及H-E染色

2.2 RPE与NR厚度测量

2.3 免疫组织化学染色

三 结果

1 非洲爪蟾RPE与NR在眼发生过程中发育分化的形态特征

2 非洲爪蟾RPE和NR厚度的测量

3 免疫组化的结果

3.1 Pax6在非洲爪蟾眼发育不同时期的表达

3.2 Pax6在非洲爪蟾眼发育不同时期表达的定量分析

四 讨论

1 关于RPE和NR在眼发育过程中厚度变化的探讨

2 关于色素在RPE极性建立与维持中的作用的探讨

3 关于Pax6在眼发育过程中作用的探讨

3.1 Pax6是一个剂量依赖性的调控子

3.2 Pax6是一个位置依赖性的调控子

五 结论

六 展望及后续研究

1 关于RPE与NR厚度机制的研究

2 关于色素颗粒在RPE极性形成中的研究

3 关于Pax6在眼发育早期和图式形成中确切的角色的研究

七 图版及说明

八 参考文献

九 致谢

十 附录