Wnt5a对根尖牙乳头干细胞体内成牙/成骨分化的影响

摘要

目的：通过建立Wnt5a过表达和沉默的根尖牙乳头干细胞（Stem cells from the apical papilla, SCAP），初步探讨Wnt5a对SCAP在体内成牙/成骨分化的影响，为进一步研究 Wnt5a对 SCAP在牙髓牙本质再生和生物学牙根发育方面的研究提供一定的理论依据和实验基础。
　　方法：
　　实验一 Wnt5a过表达和沉默的SCAP细胞系建立及鉴定
　　通过体外酶消化法和有限稀释法分离、培养人SCAP；免疫荧光染色检测SCAP间充质干细胞表面分子标志物和体外成骨成脂诱导鉴定其多向分化能力。利用Wnt5a过表达和沉默慢病毒载体，构建了稳定转染 Wnt5a过表达和沉默的SCAP细胞系；qPT-PCR和Westernblot分别检测转染后的SCAP中Wnt5a mRNA和蛋白表达情况。
　　实验二 Wnt5a过表达和沉默对SCAP体内成牙/成骨分化的影响
　　将 Wnt5a过表达和沉默的SCAP细胞系与羟基磷灰石-磷酸三钙（Hydroxyapatite/Tricalcium phosphate,HA/TCP）复合体外培养24小时，电镜（scanning electron microscopy, SEM）扫描观察SCAP与HA/TCP复合生长情况；再将细胞支架复合物移植到免疫缺陷的裸鼠背部皮下，分别（Specific pathogen Free, SPF）级培养4周、8周，取材，HE、MASSON染色观察成牙本质细胞分化、类牙本质基质及牙髓牙本质复合体形成情况，免疫组化方法检测成骨相关因子碱性磷酸酶（ Alkaline phosphatase, ALP）、牙本质涎磷蛋白（ Dentin sialo phosphoprotein, DSPP）、骨涎蛋白（Bone sialoprotein BSP）和骨钙蛋白（Osteocalcin,OCN）的表达。
　　结果:
　　1、Wnt5a过表达和沉默的SCAP细胞系构建
　　成功获得纯化SCAP细胞克隆，免疫荧光技术鉴定SCAP具有间充质干细胞特性，成骨成脂诱导分化证实其具有多向分化潜能。Wnt5a过表达和沉默病毒液以（Multiply of Infection, MOI）=10滴度为107感染SCAP；经筛选、纯化得到感染成功Wnt5a过表达和 Wnt5a沉默的SCAP细胞克隆，转染率高达90％；Wnt5a过表达组 Wnt5a mRNA和蛋白表达显著高于其空载体组及空白对照组（P<0.05），Wnt5a沉默组表达则显著低于其空载体组及空白对照组（P<0.05）。
　　2、Wnt5a对SCAP体内成牙/成骨分化的影响
　　（1）各组细胞复合 HA/TCP体外三维培养24h结果显示：各组细胞在支架材料表面和孔隙内均能顺利黏附并良好生长，形成细胞膜片样结构，成功制备细胞支架复合物；
　　（2）细胞支架复合物HE和MASSON染色结果显示：Wnt5a过表达组可见成牙本质细胞分化、分泌基质矿化，类牙本质样结构、牙本质小管样结构以及牙髓牙本质复合体样结形成；Wnt5a沉默组仅见细胞向成牙本质细胞分化，未见类牙本质样结构及基质等形成；
　　（3）复合物免疫组化结果显示：ALP、DSPP、BSP和OCN蛋白表达在对照组、Wnt5a过表达组和沉默组均有不同程度表达，且在4周表达强8周减弱。第4周ALP、DSPP、BSP和OCN表达Wnt5a过表达组高于其空载体组及空白对照组，Wnt5a沉默组低于其空载体组及空白对照组，且 Wnt5a过表达组高于 Wnt5a沉默组；但在第8周时Wnt5a沉默组ALP、DSPP、BSP表达则高于其空载体对照组及Wnt5a过表达组， OCN则在各组间未见明显差异。
　　结论：
　　1.成功利用 Wnt5a慢病毒载体构建了稳定表达 Wnt5a过表达和沉默的SCAP细胞系，转染率高达90%。
　　2. Wnt5a过表达和沉默的SCAP细胞在HA/TCP三维方向上均能良好的黏附生长，两者之间生物相容性良好，成功构建Wnt5a过表达和沉默的SCAP-HA/TCP细胞支架复合物。
　　3. Wnt5a过表达可有效诱导 SCAP向成牙本质细胞分化，促进分泌基质矿化、类牙本质基质及牙髓牙本质复合体样等结构形成；Wnt5a沉默组则延迟SCAP向成牙本质细胞/成骨细胞分化、矿化。
　　4. Wnt5a过表达可以不同程度增强ALP、DSPP、BSP、OCN成骨相关矿化因子的蛋白表达水平，而Wnt5a沉默组则可降低矿化因子ALP、DSPP、BSP、OCN的蛋白表达，以体内培养4周明显。
　　5.本研究条件下，初步证实Wnt5a对人SCAP在裸鼠体内向成牙/成骨方向分化有促进作用，为在牙组织工程中进一步研究Wnt5a对SCAP的牙髓/牙本质再生、生物学牙根形成以及牙根发育分子机制的研究提供了一定的理论基础和实验依据。

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前言

实验一Wnt5a过表达和沉默的SCAP细胞系的建立及鉴定

1 实验材料

2 实验方法

3 实验结果

4 讨论

实验二Wnt5a对SCAP体内成牙/成骨分化的影响

1 实验材料

2 实验方法

3 实验结果

4 讨论

结论

参考文献

综述: Wnt5a在牙源性干细胞方面的研究进展

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