MASP-2及其MASP-2-CCP1/2SP、-CCP2SP、-SP结构域对结核性肉芽肿形成的影响

摘要

背景和目的：结核病的主要病理变化为肉芽肿的形成，肉芽肿的形成使结核分枝杆菌的感染变得局限化，而有利于免疫细胞对其进行清除。巨噬细胞募集活化、淋巴细胞浸润是肉芽肿形成的主要细胞学基础，细胞因子、趋化因子及受体通过调节巨噬细胞、淋巴细胞功能，参与肉芽肿的形成，但是其具体机制尚未清楚。而补体系统作为机体防御外界微生物入侵的第一道屏障，在感染过程中发挥着重要的作用，但是目前肉芽肿的形成与补体的关系尚未见报道。本实验通过研究补体凝集素途径中重要的酶MASP-2来观察其对结核性肉芽肿形成的影响；对MASP-2的功能活性结构域进行预测，选择CCP1-CCP2-SP结构域进一步研究其对结核性肉芽肿形成的影响，为结核病的的免疫学防治提供新的思路。
　　方法：
　　1.建立家兔皮肤结核肉芽肿模型，观察hMASP-2重组腺病毒（rAd-hMASP-2）对肉芽肿形成、液化过程的影响。实验分为三组：BCG+PBS组、BCG+rAd组和BCG+rAd-hMASP-2组，每组4只兔子，每只兔子在腹背部皮肤选取四个点，每个点皮内注射结核分枝杆菌5×106CFU(100μl)，BCG+rAd组和BCG+rAd-hMASP-2组分别在第-3天和第4天皮下注射1×108PFU(100μl) rAd或rAd-hMASP-2，BCG+PBS组在第-3天和第4天皮下注射200μl PBS。每天对肉芽肿的体积进行测量并记录；取液化时的脓液于进行菌落计数；在初次干预前、注射BCG前、肉芽肿期、液化期及愈合期分别采血，ELISA法测定血清IL-2和IFN-γ水平。
　　2.在PDB（Protein Data Bank）数据库中找出相应的MASP-2结构域CCP1/2SP、CCP2SP、SP及C4的蛋白质结构，通过AutDock软件预测MASP-2裂解C4的功能性结构域，分别将CCP1/2SP、CCP2SP、SP结构与C4进行模拟对接并计算出相应的结合能，对接方式分为定点对接及不定点对接。
　　3.构建MASP-2结构域CCP1/2SP的真核表达载体pSecTag2B-CCP1/2SP、pSecTag2B-CCP2SP、pSecTag2B-SP，昆明鼠经鼻滴入结核分枝杆菌BCG（滴鼻剂量为1×109CFU/只）建立肺部感染肉芽肿模型。实验分为五组：①BCG+pSecTag2B-CCP1/2SP组；②BCG+pSecTag2B-CCP2SP组；③BCG+pSecTag2B-SP组；④BCG+pSecTag2B组；⑤BCG+PBS组。每周尾静脉注射两次相应的载体（25μg/次），BCG+PBS组每周注射两次等体积的PBS（200μl）。3周后处死小鼠进行相关检测：①肺组织匀浆菌落计数；②肺组织苏木素-伊红染色、抗酸染色（Ziehl-Neelsen），显微镜采集图片后用Image-Pro Plus6.0软件计算肉芽肿面积；③流式细胞术检测小鼠肺组织中CD4+T细胞、CD8+T细胞、CD4+PD1+T细胞、CD8+PD1+T细胞、CD4+Tim3+T细胞、CD8+Tim3+T细胞的数量及百分比。
　　结果：
　　1.与BCG+rAd组比较，BCG+rAd-hMASP-2组形成的皮肤肉芽肿体积（449.15±117.20mm3）明显增大(P=0.001)、载菌量（3.61×104±1.44×104CFU/g）明显减少（P<0.001）。
　　2.与BCG+rAd组比较，在肉芽肿期及液化高峰期，BCG+rAd-hMASP-2组家兔血清中IFN-γ（肉芽肿期：78.81±6.01pg/ml；液化高峰期：109.37±20.52pg/ml）及IL-2（肉芽肿期：9.90±1.41pg/ml；液化高峰期：12.76±1.52pg/ml）的水平均明显增高（P<0.05）。
　　3.对接方式为定点对接时，CCP1/2SP结构域与C4结合较为牢固，结合能为-260.8。当对接方式选择不定点对接时SP结构域与C4结合较为牢固，结合能为-440.8，但其对接位点发生变化。
　　4.与BCG+pSecTag2B组比较，BCG+pSecTag2B-CCP1/2SP组的小鼠肺组织肉芽肿面积百分比（35.21±21.91）明显增大（P=0.036），但是其肺组织中的BCG载量（1.71×104±1.91×104CFU/g）并未明显降低（P=0.912）。
　　5.与BCG+pSecTag2B组比较，BCG+pSecTag2B-CCP1/2SP组的小鼠肺组织中CD4+ T细胞的数量（4.58×104±6.15×104）、CD8+ T细胞的数量（2.61×104±5.50×103）、CD4+PD1+T细胞的数量（1.10×103±3.24×102）、CD4+Tim3+T细胞的数量（2.18×103±1.08×103）、CD8+PD1+T细胞的数量(3.66×102±2.05×102)、CD8+Tim3+T细胞的数量（5.43×103±1.93×103）均明显增高（P<0.05）。
　　结论：
　　1.MASP-2可以促进家兔皮肤结核性肉芽肿的形成，并降低液化物质中的结核菌载量。
　　2.MASP-2可以促进BCG感染的家兔血清中IL-2和IFN-γ细胞因子的分泌，表明MASP-2可以诱导BCG感染家兔的T细胞免疫向Th1型细胞分化。
　　3.通过分子对接技术，预测MASP-2结合并裂解 C4的功能性结构域为CCP1/2SP段。
　　4.MASP-2-CCP1/2SP能够促进BCG感染小鼠的肺组织中结核性肉芽肿的形成。
　　5.MASP-2-CCP1/2SP能够增加BCG感染小鼠的肺组织中CD4+T细胞、CD8+T细胞的数量，促进肺组织中淋巴细胞的聚集和活化，而参与肉芽肿的发生、发展。
　　6.MASP-2-CCP1/2SP能够增加BCG感染小鼠的肺组织中CD4+PD1+T细胞、CD4+Tim3+T细胞、CD8+PD1+T细胞、CD4+Tim3+T细胞的数量，在保护性免疫应答发挥作用的同时，诱导抑制性的免疫反应，维持肺组织免疫平衡。

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前言

第一章 MBL相关的丝氨酸蛋白酶2（MASP-2）对家兔皮肤结核肉芽肿的病理进程的影响

1.1材料与方法

1.1.1 主要的仪器设备

1.1.2 主要用的试剂

1.1.3 主要溶液的配法

1.1.4 实验方法

1.1.5 实验动物

1.1.6 实验用的菌株及表达载体

1.1.7 实验分组

1.1.8实验策略

1.1.9统计学分析

1.2结果

1.2.1 MASP-2效应酶对家兔皮肤结核结节形成过程及发展的影响

1.2.2 MASP-2效应酶对家兔皮肤结核结节液化物质中菌载量的影响

1.2.3 MASP-2效应酶对家兔皮肤结核结节皮肤的病理切片

1.2.4 MASP-2效应酶对家兔皮肤结核结节发展的不同时期血清中细胞因子水平的影响

1.3讨论

1.4结论

第二章 MASP-2活性结构的预测

2.1分子对接概述

2.2 配体与受体的相互作用的方法

2.3 对接结果

2.3 讨论

2.4 结论

第三章 MASP-2-CCP1/2SP、CCP2SP、SP结构域对小鼠结核性肉芽肿形成的影响

3.1材料与方法

3.1.1 主要的仪器设备

3.1.2 主要用的试剂

3.1.3 主要溶液的配法

3.1.4 实验方法

3.1.5实验动物

3.1.6实验用的菌株

3.1.7实验分组

3.1.8实验策略

3.1.9统计学分析

3.2结果

3.2.1 不同剂量BCG滴鼻后小鼠肺组织结核菌载量的比较

3.2.2不同剂量BCG滴鼻后小鼠肺组织肉芽肿面积的比较

3.2.3 MASP-2不同结构域处理组的小鼠肺组织结核菌载量的比较

3.2.4MASP-2不同结构域处理组的小鼠肺组织HE染色及肉芽肿面积的比较

3.2.5 MASP-2不同结构域对小鼠肺组织T细胞的影响

3.3讨论

3.4结论

总结与展望

参考文献

在读期间的研究成果

缩略词表

致谢