癌细胞力学性质测量及放射诱导下细胞损伤的生物力学研究

摘要

癌症的治疗主要包括放射治疗、外科手术、化学药物以及其他生物物理等手段。而放射治疗对于不适合手术以及化疗的患者，具有一定的优势性。重离子放射作为一种目前最好的外在放疗工具，被用于治疗多数无法手术的肿瘤。碳离子束作为重离子治癌最常用的一种放射线，基于自身独特的物理特性和生物学效应已被运用到各种肿瘤的治疗中。尤其对那些具有辐射抗性的乏氧肿瘤或者临近危险器官的深在肿瘤病例，如脑肿瘤、头颈肿瘤、肺癌、肝癌、泌尿生殖系统肿瘤及皮肤癌等，较常规放射具有更显著的疗效。由于辐射诱导细胞凋亡作为肿瘤治疗起效的关键机制，研究细胞凋亡发生的调控机制对临床中抗肿瘤治疗具有重要的意义。因此，对于如何有效地评估重离子束肿瘤治疗中的疗效、细胞杀伤机制以及引起的副作用，是完善这一先进治疗手段的必要条件。由于细胞凋亡过程不仅伴随着细胞形态学表型的改变，而且也存在细胞力学性质(机械信号)的演化，二者与凋亡分子通路之间如何耦合关联是一仍未解决的重大科学问题。在此背景下，本文基于重离子辐射的诱导作用建立了体外细胞凋亡、体内细胞损伤模型。通过采用 MTT、免疫印迹技术等分子生物学方法结合基于原子力显微镜的单细胞力学技术以及临床细胞学分析，研究如何将细胞力学特性的变化纳入到评估癌症杀伤机制、治疗效果以及副作用的研究体系当中。
　　本研究主要内容包括：⑴基于力学性质变化表征癌细胞与正常细胞之间差异，发现肝癌细胞系较正常肝细胞弹性小(软)，随着癌细胞侵袭力的增加，其细胞弹性值降低。并且细胞粘附力和粘附能量也随着癌细胞侵袭力的增加，表现一致增加的趋势。因此，提出对于具体的生物过程中选择力学特性(如细胞弹性、刚度等)用于描述评价该生物学事件，或者通过力学指标去甄别细胞演化过程中正常细胞与癌细胞的差异，这具有明显的临床应用价值。⑵基于碳离子辐射对肝癌细胞杀伤的效果，通过对肝癌细胞系和正常肝细胞体外建立经典细胞凋亡模型中调控分子通路的分析，确认了碳离子诱导肝癌细胞系经由线粒体和死亡受体途径的激活来参与凋亡发生。从力学特性表征的角度，发现凋亡过程中细胞形态、细胞力学性质、细胞骨架以及凋亡信号分子表达之间存在强相关性。这表明细胞力学性质、形态学重构与分子通路之间的紧密耦合相互作用而调控细胞凋亡的进程。针对细胞凋亡过程中体现出的典型形态学特征，应用统计热力学方法首次提出描述细胞凋亡过程的力学模型，揭示了凋亡小体出芽过程的力学机制。这些发现预示了力学性质的变化可作为评价重离子肿瘤放射治疗中杀伤效果的有效指标。⑶针对辐照对金黄地鼠红细胞损伤副作用的评价，发现不同剂量的离子辐照可导致明显的红细胞形态学的改变，且细胞数量和细胞形态学方面的损害程度，随辐照剂量的改变而微妙变化，主要体现为红细胞大小、形态以及力学性质以及辐照引起骨架蛋白spectrin-α1表达减少，这一普遍表现的结果。从力学性质与构型变化两方面阐明了离子辐射诱导红细胞损伤的生物力学机理。并首次提出红细胞刚度的变化可用于评价离子辐射引起红细胞损伤分级以及副作用的影响。⑷碳离子辐射诱导肝癌细胞凋亡的发生不仅存在保守的分子途径介导的肿瘤细胞死亡调控途径，而且也存在一个与形态-力学-分子途径三者紧密耦合交互机制来决定细胞凋亡的进程。基于生物力学方案的细胞凋亡机制的研究能为临床碳离子放射治疗中更深入的认识癌症杀伤机制提供实验支持及理论依据。而对于红细胞辐射损伤的生物力学机理研究，通过分析离子辐射诱导红细胞形态重构过程中细胞力学性质的改变，我们推断细胞形态学和力学性质的变化可以预测评估肿瘤放射治疗所产生副作用的影响。这将为临床放射治疗过程中的疗效、安全性以及副作用的评估提供一种新的策略。

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第1章 绪 论

1.1 引言

1.2 癌症研究与临床治疗现状

1.3 肿瘤放射治疗研究现状

1.4 重离子放射——传统放射线的替代手段

1.5 细胞力学的研究基础

1.6 基于AFM的癌细胞力学研究

第2章 基于AFM对不同侵袭力肝癌细胞和正常肝细胞力学研究

2.1 引言

2.2 实验部分

2.3 结果

2.4 讨论

2.5 本章小结

第3章 碳离子辐射诱导肝癌细胞凋亡的分子机理研究

3.1 引言

3.2 实验材料及方法

3.3 结果

3.4 讨论

3.5 本章小结

第4章 碳离子辐射诱导肝癌细胞凋亡的生物力学研究

4.1 引言

4.2 实验材料及方法

4.3 结果

4.4 讨论

4.5 细胞凋亡的理论研究

4.6 本章小结

第5章 放射诱导红细胞损伤的生物力学研究

5.1 引言

5.2 实验材料及方法

5.3 结果

5.4 讨论

5.5 本章小结

第6章 结论与展望

6.1 主要结论

6.2 研究展望

6.3辐射生物力学——全新的交叉学科

参考文献

英文缩略语注释

附录 A 材料、试剂、仪器以及方法

附录B 主要试剂配制及蛋白免疫印迹技术

在学期间的研究成果

致谢