PM10气动雾化法暴露后小鼠多组织毒性效应分子标记物筛选及毒性机制研究

摘要

大气污染相关疾病的发生呈逐年上升趋势，可吸入颗粒物（PM10，空气动力学直径≤10μm）作为大气污染物的主要成分，与多种疾病的发生密切相关。然而其相关毒理学资料相对匮乏，亟待进行广泛研究。深入了解和研究PM10导致的有害威胁及毒性机制，对于阐明PM10的中毒机理以及其毒性预警具有指导作用，也对政府制定环境监测指标及健康风险评价具有重要意义。基于此，本研究开创性地利用本课题组研发的气动雾化给药装置，以小鼠为模型，结合高通量测序技术和生物信息学手段，筛选对PM10毒性响应敏感的分子标记物，并研究PM10导致小鼠多组织损伤的毒性效应和机制。
　　研究结果显示：
　　1.PM10暴露导致小鼠多组织病变不同年龄小鼠（幼年、成年、老年）暴露PM10一定时间（3d，7d，15d）后，HE染色观察肺、肾脏、肝脏、心脏、大脑和睾丸组织的病理变化。结果显示，PM10对幼年小鼠的组织损伤最为严重，因此，后期实验中本研究主要利用幼年鼠为模型进行深入研究。HE结果显示，PM10暴露对肺部损伤最严重，肾脏、肝脏、心脏次之，对大脑和睾丸组织损伤最轻。肺部在暴露处理3d后就发现了炎症细胞的浸润，毛细血管和静脉扩张充血，15d暴露组这些现象更加显著，而且出现了多个病灶。肾脏组织在暴露7d后出现肾小球细胞增多，体积增大的现象。肝脏组织7和15d暴露组出现细胞浑浊肿胀，中央静脉充血及炎症细胞浸润。心脏组织只有在15d暴露组出现轻微血管扩张。大脑组织和睾丸组织在暴露期间均未发生明显病变。
　　2.PM10暴露导致小鼠显著的氧化应激为了进一步确认PM10的毒性效应，本研究依据HE染色结果提示，选择病变明显的肺部组织为对象，研究PM10对其造成的氧化损伤情况。研究结果显示，不同年龄段小鼠在PM10胁迫不同时间后，肺部组织已明显发生氧化应激。PM10暴露3d后已经显著导致肺部组织发生脂质过氧化（MDA），其中，幼年小鼠脂质过氧化水平最高，但是随时间延长，脂质过氧化水平升高不显著。氧化损伤的另一个分子指标，GSH-Px的活性也显著增加（P<0.05），相对来说，老年组小鼠GSH-Px的活性更高。
　　3.PM10在转录组水平的毒性机制为了进一步深入研究PM10的毒性机制，本研究以PM10的主要毒性靶器官肺为研究对象，利用高通量测序技术，在转录组水平研究PM10的毒性机制。PM10暴露小鼠7d，发现了1150个差异表达的编码基因，其中723个基因表达上调，427个表达下调，对其mRNA进行GO富集分析发现，PM10暴露后，在生物学过程上，主要影响应激应答、创伤应答、防御应答、炎症响应、免疫系统调节与应答、化学物刺激应答、细胞因子等生物学过程；在细胞组分上，广泛影响细胞表面、胞外空间和基质、溶酶体、细胞质、细胞膜和内质网等多种组分；分子功能上，PM10主要影响了蛋白质、脂质、钙离子、细胞外基质等的结合绑定能力。KEGG富集分析结果显示，PM10主要影响了肺的吞噬体、溶酶体、补体与凝血级联反应和抗原处理与呈递等代谢通路。
　　4.LncRNA的表达及其靶基因富集分析在LncRNA表达研究发现中，预测了6571个新型LncRNA，本研究中发现了831个LncRNA在已有数据库中已有注释。PM10暴露后，共有30个LncRNA的表达发生了显著的改变，然后通过Cis和Trans原理预测发现这些差异表达LncRNA共有103个靶基因。这些靶基因的GO分析显示，PM10暴露主要影响细胞趋化、趋化因子活性与受体绑定、细胞因子活性、细胞因子受体及G蛋白偶联受体等方面。KEGG代谢通路分析发现，PM10暴露主要影响了小鼠肺组织的细胞因子与细胞因子受体相互作用，趋化因子受体，剪切体及抗原处理与呈递等代谢通路。通过与差异表达编码基因mRNA的富集分析比较发现，LncRNA靶基因的GO富集和KEGG富集有很多重叠的地方。如炎症反应及免疫应答等相关过程与代谢通路。这也更加证明了PM10的毒性效应主要涉及应激、炎症、免疫等方面。
　　5.结合qPCR技术筛选PM10的毒性效应分子组学研究对于筛选毒物的效应分子具有独特的优势，本研究在测序数据的基础上，利用qPCR技术，在mRNA、LncRNA和circRNA三种组分中筛选了对PM10暴露敏感的分子作为生物分子指示物。结果显示，9个备选编码基因可以作为PM10暴露后肺部组织的潜在分子标记物，其中Saa3、Mmp12和Kap三个基因对PM10暴露的响应更加敏感，是更为优良的生物标记分子。但对于其他组织来说，Kap和Umod基因的表达与肺组织的响应一样，因此其可以作为肾脏、肝脏、心脏的潜在生物标记分子。LncRNA结果显示，肺组织暴露PM107d的结果与测序结果完全一致。H19和XLOC_340807的表达显著降低，而Gml2840、RP23-110C17.2、RP24-16A7.7和XLOC_3149476的表达显著上调。其中RP23-110C17.2、RP24-16A7.7更适合作为肺组织对PM10响应的标记物，尤其是早期响应标记物。由于LncRNA的表达具有很强的时空表达特异性，因此，PM10暴露后，肾脏、肝脏、心脏中这些LncRNA对PM10暴露的响应不同。因此，LncRNA并不适合作为通用的分子标记物指示PM10毒性效应。circRNA研究结果显示，PM10暴露后，并没有显著的差异表达基因，因此circRNA并不合适用于PM10的毒性效应指示分子。
　　6.PM10暴露导致炎症反应、免疫应答、内质网应激与矿物吸收信号通路发生异常为了进一步研究PM10主要毒性效应及机理，本研究对基于测序结果的信息分析数据进行了mRNA和蛋白表达水平的研究，对于PM10暴露影响显著的信号通路炎症反应、免疫应答、内质网应激与矿物吸收进行深入的研究。结果显示，PM10暴露后，四个受PM10影响显著的信号通路关键分子的表达不同程度的上调。具体来说，PM10暴露后，四种组织中，炎症反应的标志基因CXCL1，CXCL和XCL1在mRNA和蛋白水平均呈现诱导性的上调；免疫应答相关信号通路基因MRC1和MSR1的mRNA和蛋白表达在肺、肾两种组织中明显上调，另一个免疫应答蛋白CD74的表达也呈现类似的表达趋势；PM10对四种组织内质网应激的激活情况也不尽一致，Bip和CHOP基因的蛋白表达水平在PM10暴露后主要在肺、肾、肝三种组织发生明显升高，提示这三种组织发生了明显的内质网应激，而对心脏组织的影响较小；在转录水平，四种组织中Cu2+运输相关基因SLC31A1，Ca2+结合基因S100g的表达在PM10暴露后显著上调；Fe2+相关基因HMOX1只有在肝脏组织中呈现先下降后上升的趋势；细胞外液和电解质平衡调节基因Nppa的表达则受到PM10暴露而被显著抑制（肝脏组织中没有检测到该基因的表达）。在蛋白水平上，PM10暴露后，Cu2+运输相关蛋白SLC31A1和Fe2+相关蛋白HMOX1均出现程度不同的显著上调，这说明PM10暴露后也会显著影响各种矿物离子的转运和吸收。
　　综上所述，本研究表明：PM10经气动雾化法暴露后导致小鼠肺、肾、肝、心等多组织发生病理性损伤；诱导肺组织发生明显的氧化应激，大量mRNA和LncRNA差异表达；mRNA和LncRNA靶基因的GO和KEGG分析发现PM10的毒性效应主要涉及应激、炎症、免疫等方面；部分显著差异表达的mRNA和LncRNA有望作为PM10的毒性效应用于毒性预警，而circRNA则不适用于PM10的毒性效应分子标志物；炎症反应、免疫应答、内质网应激和矿物吸收信号通路关键信号分子调控的紊乱是PM10引起呼吸对象毒性效应的主要原因。

目录

声明

第一章 前言

1.1 大气颗粒物污染概述

1.2 PM10的组成及理化性质

1.3 PM10来源

1.4 PM10暴露的流行病学研究

1.5 PM10的毒性效应

1.6 可吸入纳米颗粒物

1.7 PM10的毒性机制研究

1.8 PM10与氧化应激

1.9 高通量测序技术在毒理学中的应用

1.10 长链非编码RNA

1.11 环状RNA

1.12 PM10急性暴露方法

1.13 研究技术路线

1.14 研究目的与意义

第二章 材料与方法

2.1 实验材料

2.2 主要试剂及试剂盒

2.3 主要试剂配方及仪器设备

2.4 PM10的配制

2.5 气动雾化染毒装置与动物染毒

2.6 病理切片分析-HE染色

2.7 氧化应激检测

2.8 RNA提取及qPCR

2.9 Western blot

2.10 长链非编码RNA测序-LncRNA-seq

2.11 数据分析与作图

第三章 结果

3.1 PM10暴露后小鼠的组织病理学变化

3.2 PM10暴露导致小鼠肺组织发生氧化应激

3.3 PM10暴露对小鼠肺组织转录水平基因表达谱的影响

3.4 PM10暴露后小鼠肺组织mRNA分子标记物的筛选

3.5 PM10暴露后小鼠肺组织LncRNA分子标记物的筛选

3.6 PM10暴露后小鼠肺组织circRNA分子标记物的筛选

3.7 PM10暴露对肺组织关键信号通路的影响

3.8 不同组织对PM10暴露响应的分子机制研究

第四章 讨论

4.1 PM10暴露导致小鼠多器官发生组织病理改变

4.2 PM10暴露导致小鼠发生氧化应激

4.3转录组水平研究PM10暴露对肺部损伤的分子机理

4.4 PM10的毒性效应分子标记物筛选

4.5 PM10暴露对小鼠多靶器官主要靶信号通路的影响

第五章 结论与展望

5.1 主要结论

5.2 研究展望

附录

附录I：主要溶液配方

附录II：主要仪器设备

附录III：引物信息表

附录IV: 缩略词表

参考文献

在读期间研究成果

致谢