肺结核T细胞耗竭的临床观察及动物模型治疗的实验研究

摘要

本文分为以下两个章节进行探讨：
　　第一章 兰州市肺科医院51例肺结核病患者外周血T细胞耗竭状态分析
　　全世界范围内，结核病的感染率和致死率都非常高，尤其是在中国和印度等发展中国家，结核病给社会以及个人带来了沉重的负担。在结核分枝杆菌感染的初期，大多数人能通过自身免疫力阻止结核病的进一步发展，大约10％的人群最终发展成活动性肺结核。在结核分枝杆菌（Mtb）感染的后期，机体免疫系统由于受到损伤而导致结核分枝杆菌复苏，形成慢性感染性结核，机体在长期慢性感染的作用下，主要表现为免疫功能低下。重症肺结核病人为何表现为免疫力低下？是否发生了T细胞功能耗竭？本研究通过分析临床肺结核病人外周血T细胞功能耗竭相关的几组功能学指标，来探讨慢性肺结核病人发生T细胞耗竭的机制。
　　目的：为分析慢性肺结核病人免疫功能低下的原因，探讨结核分枝杆菌在人体内的持续感染是否造成T细胞功能耗竭，研究持续痰菌阳性的空洞性肺结核病人T细胞功能的变化。
　　方法：抽取兰州市肺科医院正在住院治疗的肺结核病人51例及健康志愿者16例，分离外周血单个核细胞（peripheral blood mononuclear cells, PBMCs）。1，利用酶联免疫斑点试验（ELISPOT）检测外周血T淋巴细胞经抗原ESAT-6和CFP-10刺激后IFN-γ的分泌水平；2，利用ELISA技术检测T淋巴细胞培养基上清中IL-2的分泌水平；3，在结核菌素纯蛋白衍生物(PPD)的刺激下培养PBMCs，用流式细胞术分析外周血T细胞的增殖能力；4，检测CD4+、CD8+T细胞的数目，以及CD4+、CD8+T细胞表面免疫抑制相关分子T细胞免疫球蛋白粘蛋白分子3（T cell immunoglobulin mucin domain containingmolecules3, TIM-3）的表达；5，调取各组病人同一时期外周血血象，分析外周血中红细胞、血红蛋白、白细胞、血小板以及单个核细胞结果；6，通过分析病人性别、年龄、病程、初（复）治、痰抗酸染色、肺部影像学检查结果与T细胞耗竭相关指标的关系，来探究几种类型的慢性肺结核病人发生T细胞耗竭的情况。
　　结果：本实验室结合前期工作的基础，得出与T细胞耗竭相关的几个因素是：抗酸染色、空洞情况、病程长短。以相关的几个因素将51例肺结核病人和16例健康志愿者分成4组，即健康对照组（HD组）、痰抗酸染色阴性肺结核病人组（N-TB组）、痰抗酸染色阳性的非空洞性肺结核病人组（PNC-TB组）以及痰抗酸染色阳性空洞性肺结核病人组（PC-TB组）。1，相对于健康对照组，痰抗酸染色阴性结核病人组及痰抗酸染色阳性的非空洞性结核病人组的T细胞增殖能力及分
　　泌IFN-γ能力显著增高（P＜0.05）；2，所有肺结核病人组的IL-2表达水平较健康对照组明显下降（P＜0.05），但肺结核病人各组之间无显著性差异（P＞0.05）；3，与上述两组相比，痰抗酸染色阳性空洞性肺结核病人组T细胞增殖能力和分泌IFN-γ能力显著降低（P＜0.05）；4，所有肺结核病人组TIM-3的表达水平较健康对照组显著增高（P＜0.05），但在肺结核病人组之间的差异不明显（P＞0.05）；5，痰抗酸染色阳性空洞型肺结核人CD4+、CD4+TIM-3+T细胞的数目有所下降，但差异尚不显著（P＞0.05），可能与样本量较小有关；6，痰抗酸染色阳性空洞型肺结核病人血小板数目较其他各组出现减少，差异有统计学意义（P＜0.05），各组病人外周血中红细胞、血红蛋白、白细胞以及单个核细胞之间无显著性差异。
　　结论：1，TIM-3可能作用于肺结核病发展的整个过程；2，T细胞分泌IL-2的能力在肺结核发展的早期就开始下降；3，肺结核病人发生T细胞耗竭与抗酸染色、空洞情况、病程长短几个因素相关；4，本研究证实持续痰菌阳性的空洞性肺结核病人T细胞功能出现耗竭，提示人体内大量结核分枝杆菌持续感染可导致T细胞功能耗竭。
　　第二章 利用两种药物对肺结核T细胞功能耗竭的干预研究
　　结核病是由结核分枝杆菌引起的一种慢性传染病，它不仅可以引起肺结核也可以肺外结核，结核分枝杆菌在宿主体内长期持续存在，损害宿主的免疫功能。类似于HBV、HCV、HIV等病毒性疾病持续感染所致的T细胞耗竭，结核分枝杆菌持续感染所致的 T细胞功能耗竭越来越受到重视。发生耗竭的 T细胞主要表现是细胞表面抑制性受体增加，细胞增殖能力下降，细胞毒作用丧失以及细胞因子分泌能力降低。结核病患者一旦发生 T细胞耗竭，机体表现为免疫功能低下，疾病持续恶化，很难恢复。为逆转结核病T细胞耗竭，恢复机体免疫功能，本研究构建动物模型来验证两种逆转T细胞耗竭药物的作用。
　　目的：研究结核分枝杆菌抗原持续刺激致 T细胞功能耗竭的机制，探究补肾健脾方和二甲双胍逆转T细胞功能耗竭的作用。
　　方法：将3周龄的实验动物随机分为5组：正常对照组、抗原短暂免疫组、免疫耗竭未治疗组、免疫耗竭补肾健脾解毒方组、免疫耗竭二甲双胍治疗组。实验第1周利用BCG初免，PPD（结核菌素纯蛋白衍化物蛋白）持续刺激C57BL/6小鼠，模拟结核分枝杆菌抗菌抗原在病人体内持续存在所造成慢性感染的过程，构建 T细胞功能耗竭模型。从第7周开始，给予免疫耗竭二甲双胍治疗组饮水中给药治疗至第26周，从第24周开始，给予补肾健脾解毒方组小鼠灌胃治疗至第26周。治疗完成后检测各组小鼠细胞免疫水平，包括利用流式细胞术检测脾脏CD4+和CD8+T细胞PD-1的表达水平、CD4+和CD8+T细胞的数目；利用ELISA检测脾脏淋巴细胞分泌IL-2和IFN-γ的水平；利用肺脏BCG攻毒实验检测抗感染能力；利用流式细胞术检测造血干细胞占小鼠骨髓有核细胞的比例。
　　结果：与抗原短暂刺激组相比，免疫耗竭未治疗组CD4+和CD8+T细胞数目显著下降（P＜0.05），细胞表面PD-1的表达水平显著增高，差异有统计学意义（P＜0.01）；脾淋巴细胞分泌细胞因子IL-2、IFN-γ的水平明显降低，差异有统计学意义（P＜0.01）；小鼠抗感染的能力显著下降，差异有统计学意义（P＜0.01）；说明PPD抗原持续刺激致T细胞耗竭模型构建成功。经补肾健脾方治疗后，小鼠脾脏 CD4+T细胞表面 PD-1的表达水平显著降低，差异有统计学意义（P＜0.01），CD4+和CD8+T细胞数目得到明显恢复（P＜0.05）；小鼠脾脏T淋巴细胞分泌IL-2、IFN-γ的水平明显增高，差异有统计学意义（P＜0.01）；小鼠抗BCG感染的能力显著增强，差异有统计学意义（P＜0.01）；小鼠脾脏的炎症反应明显减轻，差异有统计学意义（P＜0.05）。经二甲双胍干预后，脾CD4+T细胞PD-1的表达显著性降低，差异有统计学意义（P＜0.01）；脾淋巴细胞分泌IL-2和IFN-γ的水平明显增高，差异有统计学意义（P＜0.01）；小鼠抗感染的能力显著性增强，差异有统计学意义（P＜0.01）。
　　结论：1，抗原PPD持续刺激可致T细胞发生耗竭；2，补肾健脾方能逆转抗原持续刺激导致的小鼠 T细胞功能耗竭，可能为临床治疗结核病 T细胞功能耗竭提供参考；3，二甲双胍对T细胞功能耗竭的进展有干预作用，提示患有二型糖尿病或者空腹血糖受损的肺结核病人口服二甲双胍的必要性。

目录

声明

第一章 兰州市肺科医院51例肺结核病人外周血T细胞耗竭状态分析

1.1引言

1.2 材料与方法

1.2.1 实验材料、试剂

1.2.2实验仪器设备

1.2.3实验对象

1.2.4实验方法

1.2.5 统计学处理

1.3实验结果

1.3.1 ELISPOT检测IFN-γ的分泌

1.3.2利用ELISA技术检测细胞培养上清中IL-2的分泌水平

1.3.3 T细胞增殖能力检测

1.3.4 CD4+、CD8+T细胞表面TIM-3分子的表达

1.3.5 各组肺结核病人CD4+、CD8+T细胞以及CD4+、CD8+TIM-3+T细胞的数目变化

1.3.6 各组病人外周血血象的变化

1.4 讨论

1.5 本章小结

第二章 补肾健脾方和二甲双胍对肺结核T细胞功能耗竭的干预研究

2.1 前言

2.2 材料与方法

2.2.1 实验材料

2.2.2 实验仪器设备

2.2.3 所用实验试剂

2.2.4 自配试剂

2.2.5实验对象

2.2.6实验方法

2.2.7数据处理

2.3实验结果

2.3.1小鼠脾CD4+，CD8+T细胞表面抑制性受体PD-1的表达情况

2.3.2 小鼠脾细胞CD4+，CD8+T细胞的数目

2.3.3小鼠脾淋巴细胞分泌IL-2 、IFN-γ的水平

2.3.4 BCG攻击后肺组织细菌载量评价

2.3.6各组小鼠造血干细胞数目

2.4讨论

2.4.1抗原PPD的持续刺激致T细胞耗竭

2.4.2 T细胞耗竭使机体免疫功能低下的机制

2.4.3 二甲双胍通过激活AMPK通路对T细胞耗竭的干预作用

2.4.4 补肾健脾方各单药成分均可调节免疫功能

2.4.5 肺结核T细胞耗竭的中医治疗思路

2.5 本章小结

参考文献

论文缩略词汇总表

硕士期间期间的科研成果

致谢