载脂蛋白B mRNA编辑酶催化亚基3A(APOBEC3A)对HIV-1启动子甲基化的调节

摘要

目的： HIV-1感染机体导致的潜伏感染是艾滋病（AIDS）无法治愈的主要原因之一，如何有效激活HIV-1潜伏病毒进而清除，是治愈AIDS的关键措施。其中HIV-1病毒潜伏库形成和维持的主要因素与HIV-1 5' LTR中CpG甲基化相关。APOBEC3A（A3A）是载脂蛋白B mRNA编辑酶催化亚基3（APOBEC3）家族成员之一，目前已经证实A3A能够识别甲基化胞嘧啶（methylcytosine，mC），参与DNA甲基化修饰的调节。A3A可以有效地激活HIV-1潜伏病毒，推测与A3A具有甲基化胞嘧啶脱氨酶活性有关，借助甲基化胞嘧啶脱氨酶活性催化5' LTR中的甲基化CpG去甲基化。为明确A3A对HIV-1启动子5' LTR上CpG岛甲基化的调节作用，通过构建并修饰携带有HIV-1启动子的甲基化载体，构建并筛选A3A异构体a(A3A Isotype a，A3A-a)和A3A异构体b(A3A Isotype b，A3A-b)高表达真核载体，分析A3A去甲基化功能，并探索其分子机制，为新型HIV病毒激活剂的研发奠定基础。 方法： 1.构建携带有HIV-1启动子5' LTR序列的载体pLTR-Luc2P-EGFP，CpG甲基化酶 M.SssI 处理载体 pLTR-Luc2P-EGFP ，得到甲基化指示载体pmeLTR-Luc2P-EGFP，用亚硫酸氢盐修饰PCR测序和甲基化敏感的限制性内切酶酶切对甲基化载体进一步鉴定。 2.HIV-1的5' LTR 序列含有八个 CpG 岛，易被甲基化，载体pmeLTR-Luc2P-EGFP的甲基化位点位于载体启动子区域，并携带Luc2P和EGFP两个指示标志，因此分别用三种方法检测甲基化水平：（1）蛋白印迹（Western Blotting，WB）方法检测EGFP的表达，（2）荧光素酶方法检测相对荧光素酶活性和相对荧光素酶比值，（3）Real-Time PCR方法进行Hpa II敏感性分析。分别转染甲基化质粒pmeLTR-Luc2P-EGFP和未甲基化质粒pLTR-Luc2P-EGFP，验证初步选取的三种甲基化检测方法可行；转染不同甲基化程度（100%、75%、50%、25%、0%）的质粒，验证三种甲基化检测方法能检测不同的甲基化梯度，结果进行Pearson相关性分析，将0%、25%、50%、75%、100%设定为相应甲基化程度（100%、75%、50%、25%、0%）的标准值，对三种方法的测得值和标准值之间的相关性进行评价。 3.从THP-1细胞mRNA中扩增得到A3A-a和A3A-b的cDNA，分别克隆至真核表达载体pASIB-HA和pCAGGS-HA。转染HEK-293T细胞，蛋白印迹检测A3A-a和A3A-b的蛋白表达，并筛选出A3A-a和A3A-b的高表达载体。 4.将A3A-a、A3A-b高表达载体和阴性对照载体pASIB-HA-A3G与甲基化载体pmeLTR-Luc2P-EGFP分别共转染HEK-293T，在细胞水平中，WB方法检测指示蛋白 EGFP 表达和荧光素酶方法检测相对荧光素酶活性，评价 A3A-a 和A3A-b的去甲基化调节作用。 5. 将 A3A-a 高 表 达 载 体 转 染 HEK-293T 细 胞 ，免 疫 共 沉淀（Co-Immunoprecipitation，Co-IP）检测A3A和胸腺嘧啶糖苷酶（Thymine DNA glycosylase，TDG）的相互作用，研究A3A去甲基化分子机制。 结果： 1.经双酶切和测序鉴定携带有 HIV-1 启动子 5' LTR 序列的载体pLTR-Luc2P-EGFP成功构建；CpG甲基化酶M.SssI处理，成功得到甲基化指示载体pmeLTR-Luc2P-EGFP；经亚硫酸氢盐修饰PCR测序和甲基化敏感的限制性内切酶酶切鉴定，证实甲基化处理有效。 2.用WB、荧光素酶和Real-Time PCR方法检测甲基化水平。与未甲基化质粒 pLTR-Luc2P-EGFP 转染组相比发现，甲基化指示载体 pmeLTR-Luc2P-EGFP转染组：（1）EGFP蛋白表达水平明显减弱；(2)相对荧光素酶活性明显减弱；（3） Hpa II的敏感性明显减弱。这些结果证实，甲基化指示载体pmeLTR-Luc2P-EGFP的甲基化处理有效，并验证了上述三种方法可以用于甲基化检测。通过转染不同甲基化程度的质粒，随着甲基化程度的减弱：（1）EGFP蛋白表达水平逐渐增高；（2）相对荧光素酶活性和相对荧光素酶比值逐渐增强；（3）Hpa II的敏感性逐渐增高；Pearson 相关性分析，结果显示上述三种方法的测得值和标准值之间均呈较强正相关，Real-Time PCR方法相关性最好，WB方法次之，荧光素酶方法相对较低；这些结果验证了三种方法可以用于检测不同程度的甲基化水平。 3.PCR、酶切鉴定和测序结果均表明A3A真核表达载体pASIB-HA-A3A1-a/b、pCAGGS-HA-A3A2-a/b 构建成功。经过 WB 筛选，pCAGGS-HA-A3A3-a 和pCAGGS-HA-A3A3-b中A3A蛋白表达量较高，并用于后续实验。 4.甲基化载体共转染结果显示，相较于对照A3G转染组，A3A-a 和 A3A-b组中EGFP的表达量明显上调，相对荧光素酶活性明显增强。 5.Co-IP 结果显示，在 A3A 和 TDG 蛋白位置处有明显条带，提示 A3A 与TDG蛋白存在相互作用。 结论： 1.在细胞水平上证实A3A分子异构体a和异构体b均可识别DNA中5-甲基胞嘧啶，催化HIV-1启动子CpG岛去甲基化，为进一步研究A3A对HIV潜伏感染调控奠定基础。 2.A3A与TDG存在相互作用，提示A3A可能通过TDG依赖的活性DNA去甲基化途径参与5-甲基胞嘧啶去甲基化。

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