拟南芥生育酚环化酶基因（VTE1）与烟草维生素E含量和抗性关系的研究

摘要

生育酚又称维生素E(VE)，是一类重要的脂溶性抗氧化剂，是植物在逆境下细胞膜上重要的效应物。生育酚环化酶(TC)催化形成抗氧化芳香环并最终形成相应的生育酚，在拟南芥中TC是由VTE1编码的。本实验利用根癌农杆菌(Agrobacteriumtumefaciens)介导法在烟草中过量表达拟南芥来源的VTE1，检验其对提高烟草维生素E含量的效应。同时为验证生育酚水平与外界胁迫程度的相关性，本实验还研究了转基因烟草对高光强、高盐等胁迫条件的耐受性，为植物抗逆机理的研究奠定基础。主要实验结果如下： Southern杂交和RT-PCR检测发现有10株转基因烟草扩增出特异条带，经测定，转基因烟草的VE含量普遍比野生型高2倍左右，最多的可达11.32倍，表明TC是生育酚合成途径中的关键限速酶，过量表达VTE1基因可以有效地提高生育酚的含量。 对盐胁迫下烟草叶片枯死程度进行分析发现，转基因烟草叶片枯死面积较野生型烟草小。在不同浓度(150、250mmol/L)盐胁迫下转基因烟草VE含量比野生型增加了1.3-1.8倍，说明植物体内VTE1的过量表达在一定程度上提高了转基因烟草对盐胁迫的耐受性。同时，野生型烟草中脯氨酸含量随盐浓度的升高而升高，而转基因烟草中脯氨酸含量则是先升高后降低，野生型烟草和转基因烟草的脯氨酸含量在150mmol/L下分别是0mmol/L的2.43倍和9.94倍，在250mmol/L下分别是0mmol/L的4.99倍和6.44倍，推测在一定逆境条件下，生育酚水平的变化会引起植物体内脯氨酸的更大积累，协同作用共同抵抗外界不良环境。 对野生型和转基因烟草进行光胁迫处理发现，在不同强光照时间下，转基因烟草的VE含量均比野生型烟草的高，有的甚至高达6.2倍。不同时间内的强光处理，转基因烟草和野生型烟草的超氧化物歧化酶(SOD)活性均表现为先增加、后降低、再增加的趋势，而且在整个处理过程中野生型烟草的SOD活性始终高于转基因烟草。强光处理过程中，野生型和转基因烟草中的过氧化物酶(POD)活力均呈现上升趋势，当光胁迫30h后，野生型烟草POD活性增加量高于转基因烟草。强光胁迫下产生的丙二醛(MDA)含量也逐渐增多，处理30h后，转基因烟草和野生型烟草的MDA含量最多，表明植物受伤害逐渐严重，但转基因烟草MDA累积量相对较少，表明其受伤害程度比野生型烟草轻，说明高含量生育酚与细胞内其它抗氧化剂交互作用可以降低胁迫对植物的伤害。 综上所述，生育酚环化酶基因VTE1过量表达可以在一定程度上提高植物的抗逆性，烟草在受到逆境胁迫时，起抗氧化作用的酶促系统的超氧化物歧化酶、过氧化物酶和非酶促保护系统的生育酚之间存在某种交错复杂的协调机制，当其中一类抗氧化物的活性降低，所产生的可能的氧化物的积累将诱导另外一类抗氧化物水平的提高，由于作用方式的不同，在一定胁迫下不同抗氧化剂对不同的胁迫可能存在响应时间和响应强度的差别，根据我们的实验，短时间的强光胁迫便可诱导生育酚的高表达，其后可能与酶系统交互变化从而维持植物抗氧化系统的动态平衡。

目录

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摘要

第一章 前言

1维生素E研究进展概述

1.1维生素E的研究历史

1.2维生素E的基本结构与主要种类

2维生素E的作用

2.1维生素E的抗氧化和光保护机作用

2.2维生素E的细胞内信号传导上的功能

3 VE代谢的基本途径

3.1VE生物合成的基本途径

3.2维生素E生物合成中的关键酶基因及其调节基因

4维生素E代谢工程研究进展

5本研究的目的及意义

5.1拟南芥VTE1基因对提高烟草维生素E含量的效应

5.2高含量生育酚对植物的抗逆性的效应

第二章 材料与方法

1实验材料

1.1植物材料

1.2菌株与质粒

2实验方法

2.1正义表达载体的获得

2.2反义表达载体构建

2.3烟草遗传转化及转基因烟草的获得

2.4转基因烟草分子检测

2.5转基因植株表型分析

2.6VE含量测定（按改进后的闵锐等方法测定）

2.7转基因烟草植株对胁迫耐受性的鉴定

第三章 结果与分析

1转基因烟草植株的获得

2转基因烟草的分子检测

2.1转基因烟草的PCR检测

2.2转基因烟草的PCR-Southern杂交检测

2.3转基因烟草植株RT-PCR检测

3转基因与非转基因烟草表型分析

4转基因与非转基因烟草VE含量的测定

5转基因烟草耐受性分析

5.1转基因烟草的耐盐性分析

5.2转基因烟草的耐强光分析

第四章 讨论与总结

1野生型与转基因烟草的表型分析

2野生型与转基因烟草VE含量比较

3盐胁迫总结

4强光胁迫下野生型与转基因烟草VE含量比较

5强光胁迫下超氧化物歧化酶（SOD）活性比较

6强光胁迫下过氧化物酶（POD）活性比较

7强光胁迫下丙二醛（MDA）含量比较

8小结

参考文献

在学期间发表的论文

致谢