约氏疟原虫表达的巨噬细胞迁移抑制因子同源蛋白的功能及新疟疫苗候选抗原的免疫研究

摘要

疟疾目前仍然是世界上严重危害人类健康的主要传染病之一,导致全球每年一百万人左右死亡。疟疾的发病机理非常复杂,人们对它的了解十分有限。疟原虫能够在宿主体内长期存在,很大一部分原因是疟原虫能干扰宿主的免疫反应和逃避宿主的免疫压力。巨噬细胞迁移抑制因子(MIF)是宿主分泌的一种多功能的,具有免疫调节作用的促炎性细胞因子。它可参与宿主对凶险型疟疾(Plasmodium falciparum)感染的免疫调节。有趣的是,疟原虫表达了一种巨噬细胞迁移抑制因子的同源蛋白,它可能在疟原虫干扰宿主的免疫反应中发挥作用。本研究克隆表达来源于约氏疟原虫的巨噬细胞迁移抑制因子同源蛋白(rPyMIF),研究其在体外对小鼠单核巨噬细胞的趋化作用和细胞因子的诱导功能,同时也研究了rPyMIF在体内对小鼠外周血液中游离的网织红细胞数量的影响。结果显示rPyMIF蛋白能够结合在小鼠脾脏中CD11b阳性细胞(主要为单核巨噬细胞)上,并在体外抑制小鼠CD11b阳性细胞随机迁移的能力；rPyMIF蛋白不能直接诱导小鼠CD11b阳性细胞产生细胞因子,但能改变12S诱导CD11b阳性细胞产生的细胞因子的数量。此外研究还发现注射rPyMIF蛋白能使小鼠外周血中的网织红细胞数量暂时性地降低。另外我们还将rPyMIF蛋白免疫小鼠,观察该蛋白免疫对小鼠感染致死性约氏疟原虫(Py17XL)的感染率和感染过程中免疫反应的影响。结果显示,在感染后第三天,rPyMIF免疫小鼠的原虫率比对照小鼠显著性降低。并且在感染过程中,rPyMIF蛋白免疫使更多的单核巨噬细胞从骨髓迁移至脾脏,和更多的单核巨噬细胞处于激活状态。然而,rPyMIF的免疫作用对小鼠感染Py17XL的原虫率的影响是短暂的,在感染后第4天开始,rPyMIF免疫小鼠与对照小鼠的原虫率没有显著差异。本研究结果说明约氏疟原虫来源的MIF对小鼠感染致死性约氏疟原虫(Py17XL)的原虫率只有轻微的影响,但它能参与调节红内期宿主的网织红细胞的产生和单核巨噬细胞的迁移和活化过程。
　　 由于疟原虫抗药性和蚊媒耐药性的不断扩展,疟疾药物防治面临困境,研制有效的抗疟疫苗是当前的迫切需要。已经有很多疟原虫抗原被鉴定并进行疟疾疫苗的尝试,但至今还没有取得令人满意的结果。最近的一项用分子多态性的方法筛选出几个新的恶性疟原虫疫苗候选基因。为了能在动物模型中研究疟原虫候选抗原的免疫保护效果,本课题研究其中一个候选抗原在约氏疟原虫中的同源蛋白Py01157。我们在大肠杆菌中克隆表达了Py01157蛋白相对保守的N端350个氨基酸序列(rPy01157-Nt),探索其在小鼠体内的免疫原性和其免疫作用对小鼠抵抗约氏疟原虫感染的保护效果。同时也观察了Py01157蛋白在受感染红细胞内的定位。免疫印迹实验结果显示,rPy01157-Nt蛋白能够被Py17XNL感染康复的小鼠血清识别,也能被非洲马里(Mali)疟原虫流行区域的居民免疫血清所识别。同时rPy01157-Nt蛋白免疫的小鼠血清也能识别约氏疟原虫Py17XL的虫体抗原。这些结果说明了Py01157蛋白是宿主免疫系统识别的蛋白之一,具有免疫原性,能使宿主产生抗Py01157蛋白的抗体；同时也说明表达的Py01157Nt—trxA重组蛋白具有免疫原性,并且具有和天然Py01157蛋白相似的抗原表位。此外约氏疟原虫的Py01157蛋白和人疟原虫的同源蛋白还具有相似的抗原表位。免疫荧光实验结果表明Py01157蛋白表达于疟原虫的细胞质中。动物实验结果显示rPy01157-Nt蛋白的免疫对小鼠抵抗约氏非致死性疟原虫Py17XNL的感染有部分的保护作用,但对约氏致死性疟原虫Py17XL的感染没有保护效果。
　　 本课题也研究了另外一个疟原虫候选抗原:约氏疟原虫裂殖子表面蛋白9(PyMSP-9)。实验克隆表达了PyMSP-9 N端450个氨基酸(rPyMSP-9-Nt),其中包含了疟原虫MSP-9蛋白主要的保守区域；同时也构建了PyMSP-9全基因和PyMSP-119的DNA核酸疫苗。通过重组蛋白疫苗和DNA核酸疫苗的不同组合的免疫方式,观察其对小鼠抵抗约氏致死性疟原虫Py17XL的保护作用。动物实验结果表明,rPyMSP-9-Nt蛋白或PyMSP-9核酸疫苗的免疫作用对小鼠感染高剂量的约氏致死性疟原虫Py17XL没有保护效果。但该蛋白或DNA疫苗对低剂量的约氏致死性疟原虫Py17XL和约氏非致死性疟原虫Py17XNL感染的保护作用有待进一步探讨。
　　 本论文的研究对深入探讨疟原虫逃逸宿主的免疫反应和感染的机制提供前提的基础研究,也为疟疾疫苗的开发提供了重要的实验依据。