干扰了FVB小鼠肾组织OREBP/NFAT5的表达并诱发了类似于人类尿崩症的表现型

摘要

目的：miR-466(a/b/c/e)-5p/3p miRNAs是两组高度保守的miRNAs,其中-5p组间和-3p组间miRNAs的序列几乎完全一样。生物信息学分析和我们的前期研究显示,miR-466 miRNAs可能可以在肾组织中对渗透应激调控转录因子OREBP/NFAT5进行转录后表达调控。我们因此希望研究miR-466a在转基因小鼠中的过表达对小鼠肾组织OREBP/NFAT5的表达和小鼠尿液浓缩机制的影响。
　　 方法：通过PCR从小鼠基因组中扩增miR-466a基因序列,将片段插入鸡β-actin promoter下游构建过表达质粒pBact-miR-466a,然后用限制性内切酶酶切将转基因片段释放出来用于显微注射受精卵制备FVB遗传背景的转基因小鼠。小鼠基因型鉴定通过剪尾巴提取基因组DNA进行PCR分析。通过Real-timeRT-PCR检测miR-466a、OREBP/NFAT5、AQP2、AQP3、UT-A2在转基因小鼠肾脏中表达情况。收集1.5-2ml野生型(WT)和miR-466a转基因(miR-466aTg1)小鼠尿液和血清测定尿液和血清中钠离子、钾离子、钙离子、镁离子、氯离子、尿素、肌酸酐、白蛋白等溶质含量和渗透浓度。收集雄性8周龄WT和miR-466aTg1小鼠24小时期间的水摄入量和尿液排出量数据。尿浓缩能力是采用对雄性8周龄W和miR-466aTg1小鼠腹腔注射0.4μg/kg/mouse去氨加压素(dDAVP),收集注射药物前尿液和注射药物后2小时尿液以分析尿液渗透压。
　　 结果：我们已创立了三个品系的miR-466a转基因小鼠。Real-time RT-PCR分析发现,miR-466aTg1小鼠肾脏皮质和髓质中OREBP/NFAT5表达量较WT降低了30％(p＜0.001)和20％(p＜0.01),SMIT表达量较WT降低了40％(p＜0.001),AQP2表达量较WT分别降低了26％(p＜0.05)和33％(p＜0.05),AQP3表达量较WT分别降低了30％(p＜0.01)和46％(p＜0.001),UT-A2表达量较WT降低了65％(p＜0.01),UT-A3/5表达量较WT降低了50％(p＜0.01),UTB表达量较WT分别降低了14％(p＜0.05)和30％(p＜0.05)。miR-466aTg1小鼠24小时期间的水摄入量较W多约2ml(p＜0.001),24小时期间的尿液排出量较WT升高约2倍(p＜0.001)。miR-466aTg1注射dDAVP前后尿液渗透压较WT低约500mOsmol/kg(p＜0.01)。同时,miR-466aTg1小鼠尿液多种溶质含量较WT小鼠尿液均有所下降,同时血清多种溶质含量较WT小鼠血清均有所上升。
　　 结论：miR-466a在转基因小鼠的过表达显著抑制了渗透调控转录因子OREBP/NFAT5及其靶基因的表达,进而显著影响小鼠的尿液浓缩机制。miR-466a因而是渗透调控和尿液浓缩机制的重要调控基因。