东太平洋、南大西洋与西南印度洋深海沉积物真菌多样性分析及产油脂真菌的筛选

摘要

海洋面积约占地球表面积的71％，在海洋中蕴藏着丰富的生物资源。许多研究者都希望可以开发广阔的海洋资源。目前已发现的海洋微生物类群主要包括:病毒，古菌、细菌、放线菌及真菌。真菌属于真核微生物并且占据了陆地、水生和海洋等不同的栖息地。海洋真菌包括了一小群生态意义明确的丝状子囊菌，它们的无性型以及酵母，但是至今为止几乎没有关于这些的研究。目前被列出的已描述的高等海洋真菌有属于244个属的467种。
　　 深海一般指的是位于海洋1000米以下的区域。深海真菌是海洋微生物的一个重要类群，在海洋生态系统中发挥着不可缺少的作用。有关深海沉积物真菌的研究还相对较少，但是随着分子生物学技术的飞速发展，有关深海真菌的研究也是在逐渐增加。
　　 本实验的主要目的是研究深海沉积物的真菌多样性及筛选产油脂深海真菌。本实验所研究的菌株均是采集分离自21航次东太平洋、南大西洋及西南印度洋共15个站位沉积物的酵母和丝状真菌。主要做了以下几方面的工作:
　　 1.采用分子生物学方法(PCR)，对南大西洋和东太平洋4个站位的沉积物分离到的93株酵母以及南大西洋、东太平洋和西南印度洋14个站位沉积物分离到的80株丝状真菌进行了分子鉴定。观察了其中一些丝状真菌的孢子显微形态并进行了图片拍摄工作。结果发现:93株酵母属于Rhodosporidium paludigenum和Rhodotorula mucilaginosa两种，其中有34株属于Rhodosporidium paludigenum，59株属于Rhodotorula mucilaginosa;80株丝状真菌共属于14个属，它们分别是:Penicillium sp.(31株),Aspergillus sp.(17株),Cladosporium sp.(13株),Alternariasp.（5株），Fusarium sp.（3株），Tritirachium sp.（2株），Tilletiopsis sp.（1株），Sistotremasp.（1株），Aschersonia sp.(1株),Phoma sp.(1株),Exophiala sp.(1株)，Engyodontium sp.（1株），Acremonium sp.（2株），Chaetomium sp.（1株）。经过多样性分析，本论文得出:南大西洋和东太平洋这4个站位的酵母菌的多样性都不高，每个站位所分离到的酵母菌都只有2种。在南大西洋DY115-21Ⅳ-S1-TVG1和东太平洋 DY115-21Ⅲ-S7-TVG3、DY115-21Ⅲ-S10-TVG6这3个站位中Rhodotorula mucilaginosa分布比Rhodosporidium paludigenum广泛，而在南大西洋DY115-21Ⅳ-S11-TVG8这个站位中则是Rhodosporidium paludigenum略多于Rhodotorula mucilaginosa。在三个海区的14个站位中属于Penicillium sp.的菌株最多，这表明青霉属在这些站位是广泛分布的，是这三个大洋14个站位中的优势属。其次，曲霉属和枝孢霉属的也有比较广泛的分布。其余属均只有几株，表明在三个大洋中分布较少。西南印度洋的可培养丝状真菌多样性更加丰富一些。
　　 2.采用不同的筛选方法来进行产油脂酵母和丝状真菌的初步筛选。对于采集分离到的酵母，我们采用了荧光显微镜观察添加尼罗红荧光染色的酵母细胞的方法进行产油酵母的筛选;而对于采集分离所得到的丝状真菌，我们采用了向培养平板中添加TTC观察菌落染色情况的方法进行产油丝状真菌的筛选。经过初步的筛选，共得到6株产油酵母菌和8株产油丝状真菌。其中，产油酵母属于Rhodosporidium paludigenum和Rhodotorula mucilaginosa2种，有5株是Rhodosporidium paludigenum，1株属于Rhodotorula mucilaginosa。产油丝状真菌分别属于Aspergillus sp.、Penicillium sp.、Acremonium sp.、Aschersonia sp.和Fusarium sp.5个属。其中Penicillium.sp.、Acremonium sp.和Fusarium sp.属中各有2株是产油菌，其余两属中均只有1株是产油菌。
　　 3.对初步筛选出来的产油真菌菌株进行了复筛，即测定其油脂百分含量，并对产油真菌进行了脂肪酸成分的测定。实验结果发现筛选到的产油酵母生物量均在4 g/L左右，其油脂百分含量在20.25％-36.62％之间，油脂得率系数在1.28-2.47之间;而产油丝状真菌的生物量为1.29-7.07 g/L，油脂百分含量在26.03％-62.20％之间，油脂得率系数范围是0.81-5.16。由此可以看出，初步筛选得到的菌株都符合产油菌的定义，产油丝状真菌比产油酵母总体的油脂百分含量高。对筛选到的产油酵母和丝状真菌进行了脂肪酸成分的测定，结果显示产油脂酵母所含的脂肪酸甲酯主要为油酸甲酯(C18∶1)、棕榈酸甲酯(C16∶0)和硬脂肪酸甲酯(C18∶0)。而产油脂丝状真菌所含的的脂肪酸甲酯成分主要是顺6，9-十八碳二烯酸甲酯或硬脂酸甲酯（C18∶0）、棕榈酸甲酯(C16∶0)和油酸甲酯(C18∶1)。

目录

声明

Contents

摘要

1．绪论

1．1 海洋微生物及深海真菌

1．1．1 海洋微生物

1．1．2 海洋真菌

1．1．3 深海沉积物的真菌多样性的研究概况

1．1．4 深海沉积物真菌多样性的研究方法

1．2 微生物油脂

1．2．1 微生物油脂概述

1．2．2 微生物油脂的研究概况

1．2．3 产油微生物种类

1．2．4 产油微生物产油脂机理

1．2．5 产油微生物的筛选方法

1．2．6 产油微生物的优势和缺陷

1．3 本课题研究目的、意义和研究内容

1．3．1 本课题研究目的及意义

1．3．2 研究内容

2．材料与方法

2．1 实验材料

2．1．1 菌种来源

2．1．2 培养基

2．1．3 主要试剂

2．1．4 主要仪器

2．1．5 分析软件

2．2 基本方法

2．2．1 酵母和丝状真菌的分子鉴定

2．2．2 产油脂真菌菌株的初步筛选

2．2．3 产油脂真菌菌株的复筛和脂肪酸成分的测定

3．结果与分析

3．1 酵母和丝状真菌分子鉴定结果

3．1．1 酵母菌分子鉴定结果

3．1．2 丝状真菌的分子鉴定结果

3．1．3 丝状真菌显微形态的观察

3．2 产油脂真菌的初筛结果

3．2．1 产油酵母菌初步筛选结果

3．2．2 TTC筛选产油膳丝状真菌结果

3．3 产油真菌菌株的复筛及脂肪酸成分分析

3．3．1 产油酵母菌菌株复筛

3．3．2 产油丝状真菌的复筛

3．3．3 产油真菌的脂肪酸成分分析

4．讨论

4．1 酵母菌和丝状真菌的分子鉴定

4．2 产油脂微生物的初步筛选

4．3 产油脂微生物菌株的复筛及脂肪酸成分的分析

5 总结与展望

5．1 总结

5．2 展望

参考文献

致谢

附录