基于全自动管式化学发光免疫检测系统的人血清铁蛋白定量检测试剂的研制

摘要

缺铁性贫血（irondeficiencyanemia，IDA）是由于各种不同的原因导致体内储存铁缺乏，影响细胞血红素的生成而导致的贫血。缺铁性贫血是世界范围内最常见的营养缺乏病之一，影响着约10亿人口。
　　从缺铁发展到缺铁性贫血是一个缓慢的过程，一般经历铁缺乏期（irondeplete，ID）、缺铁性红细胞生成期(irondeficiencyerythropoiesis，IDE)和缺铁性贫血期。发生缺铁和缺铁性贫血不仅会影响身体正常的机能，还可能导致胎儿和儿童的智力发育受到不可逆转的影响。通常机体内储存铁的量与血清铁蛋白的水平成正相关，机体内血清铁蛋白的水平是评价机体储存铁缺乏和诊断缺铁性贫血灵敏、特异的指标。血清铁蛋白的检测对尽早地发现缺铁并预防缺铁性贫血的发生具有重要意义。本研究制备了人铁蛋白抗原和抗人铁蛋白抗体，进而建立了适用于全自动管式化学发光免疫分析系统的人血清铁蛋白化学发光免疫定量检测试剂，试剂检测性能与国际主流同类试剂相当。
　　本研究利用大肠杆菌表达系统表达了人铁蛋白H、L亚基(FTH1，FTL)，所表达的蛋白经热处理、凝胶过滤层析、阴离子交换层析等方法纯化，获得了纯度较高的rhFTH1和rhFTL。经过SDS-PAGE、分子筛层析和透射电镜观察等方法证实了纯化的rhFTH1、rhFTL能在体外自组装成与天然铁蛋白类似的二十四聚体样结构颗粒。
　　用原核表达的人铁蛋白H、L亚基形成的颗粒抗原免疫小鼠，显示rhFTL具有较好的免疫原性;以rhFTL和天然提取的人肝脏铁蛋白为筛选抗原进行单克隆抗体的筛选，最终获得了22株铁蛋白特异性的单克隆抗体。鉴定了其中16株IgG亚型的单克隆抗体的基本性质，其中有12株抗体的效价达106以上。
　　对研究中筛选到的12株反应性较好的单克隆抗体进行抗体配对，以铁蛋白标准品进行配对初筛、临床标本进行配对复筛获得了2个可用的抗体配对。根据配对抗体建立人血清铁蛋白化学发光免疫定量检测试剂，分析其检测灵敏度、线性范围及与对照试剂检测血清标本的相关性，结果显示建立的人血清铁蛋白化学发光免疫定量检测试剂的分析灵敏度为0.5ng/ml，定量线性范围为1-2000ng/ml，检测临床血清标本的结果与Beckman公司的人血清铁蛋白化学发光免疫定量检测试剂的相关性r2达0.95以上。
　　综上所述，本研究成功制备了人铁蛋白重组抗原，获得了人铁蛋白特异性抗体，建立了人血清铁蛋白化学发光免疫定量检测试剂，检测性能与国际主流同类试剂相当，为建立国产化的人血清铁蛋白化学发光免疫定量检测试剂奠定了基础。

目录

声明

摘要

Abbreviations

第一章 前言

1．缺铁性贫血

1．1 贫血概述

1．2 缺铁性贫血(IDA)

1．3 缺铁性贫血的实验室诊断

1．4 缺铁性贫血的预防和治疗

2．血清铁蛋白

2．1 铁蛋白简介

2．2 铁蛋白的结构和功能

2．3 铁蛋白的理化性质及自组装

2．4 人血清铁蛋白

3．全自动管式化学发光免疫检测系统

3．1 化学发光免疫分析技术

3．2 全自动管式化学发光免疫分析仪

4．重组铁蛋白纳米颗粒的应用

4．1 磁性铁蛋白纳米颗粒与肿瘤诊断

4．2 药物载体与肿瘤治疗

4．3 生物大分子检测

4．4 疫苗开发

5．本研究的目的、思路和意义

第二章 材料与方法

1．材料

1．1 主要仪器

1．2 主要试剂与材料

1．3 常用溶液及培养基的配制

2．方法

2．1 分子生物学实验方法

2．2 蛋白诱导表达、纯化及鉴定方法

2．3 小鼠免疫

2．4 杂交瘤的筛选

2．5 单抗的制备和性质鉴定

2．6 酶联免疫吸附试验

2．7 管式化学发光免疫分析试验

第三章 结果与分析

1．重组人铁蛋白H、L亚基的表达与纯化

1．1 人铁蛋白H、L亚基表达质粒的构建

1．2 重组人铁蛋白H、L亚基的表达与纯化

1．3 重组人铁蛋白H、L亚基聚体性质分析

1．4 小结

2．人铁蛋白单克隆抗体的制备与鉴定

2．1 人铁蛋白纳米颗粒免疫小鼠及血清评价

2．2 铁蛋白单克隆抗体的筛选

2．3 铁蛋白单克隆抗体的鉴定

2．4 小结

3．人血清铁蛋白定量检测试剂的建立及初步评价

3．1 人血清铁蛋白定量检测试剂的建立

3．2 人血清铁蛋白定量检测试剂的初步评价

3．3 人血清铁蛋白定量检测试剂配对单抗稳定性评价

3．4 小结

第四章 讨论

1．重组人铁蛋白H、L亚基的表达、纯化、体外自组装与应用

2．人血清铁蛋白特异性单克窿抗体的筛选

3．化学发光免疫定量分析试剂的开发

小结与展望

1．小结

2．展望

参考文献

致谢