构建阿霉素核-H亚基铁蛋白且用于药效分析、抑制HepG2细胞生长的差异蛋白质组学研究

摘要

人铁蛋白由于具有独特的纳米笼状结构、合适的大小、良好的生物安全性以及易于通过化学或遗传学的方法进行表面改造等特性而成为理想的肿瘤靶向给药载体，因而受到了科学家们的广泛关注。本文构建了pET-21 b-FTH1、pET-28a-FTH1和pGEX-4T-1-FTH1三种人铁蛋白H亚基原核表达载体，经检测，三种表达载体中pGEX-4T-1-FTH1的表达效率最高，且在0.3 mM IPTG、25℃条件下诱导表达能够同时兼顾表达效率和融合蛋白溶解性。经SDS-PAGE与PMF鉴定，pGEX-4T-1-FTH1表达的重组融合蛋白在切除GST标签后确为人铁蛋白H亚基。而且，经透射电子显微镜观察，重组人铁蛋白H亚基能够在生理条件下自发组装成缺铁核人H亚基铁蛋白(HFt)的纳米笼状结构。
　　阿霉素与顺铂均为临床上治疗肿瘤的一线用药，但它们都存在半衰期短、副作用大等不足。本文首先构建了阿霉素核-H亚基铁蛋白(D-HFt)，其阿霉素包装量约为24.8％（质量分数）。荧光显微镜观察显示，FITC标记的HFt能与HepG2细胞靶向结合并进入细胞的内部。异体移植HepG2肿瘤的裸鼠活体（in vivo）与离体（ex vivo）成像显示，近红外荧光染料Cy7.5标记的D-HFt在荷瘤裸鼠体内的半衰期较阿霉素要长得多，且D-HFt具有很好的肿瘤靶向性。异体移植HepG2肿瘤裸鼠的治疗实验显示，在同等给药剂量和给药频率的条件下，D-HFt对肿瘤生长的抑制情况优于阿霉素。同时，治疗后荷瘤裸鼠主要器官石蜡切片的苏木精—伊红染色显示未观察到D-HFt对荷瘤裸鼠的主要器官造成明显的病理异常如出血、水肿、淋巴细胞浸润、坏死等现象。
　　液相色谱-质谱联用(LC-MS)技术是目前蛋白质组学研究的主要技术手段之一。本文利用LC-MS对D-HFt与阿霉素作用于HepG2细胞24 h后的差异表达蛋白质组进行了研究，找到了37个差异表达的蛋白。其中EEF1A1等19个蛋白在D-HFt组中表达上调，CFL1等18个蛋白表达下调。这些结果为进一步研究D-HFt较阿霉素具有更好的疗效所蕴含的分子机制奠定了基础。
　　另外，本文还构建了纳米顺铂核-H亚基铁蛋白(NCC-HFt)，并利用LC-MS对NCC-HFt与顺铂作用于HepG2细胞24 h后的差异表达蛋白质组进行了研究，找到了24个差异表达的蛋白。其中AHSG等19个蛋白在NCC-HFt组中表达上调，ALDOA等5个蛋白表达下调。这些结果有利于进一步研究NCC-HFt所具有的缓释作用对疗效的影响。

目录

声明

摘要

缩略语

1 前言

1．1 铁蛋白

1．1．1 铁蛋白的发现与组成

1．1．2 铁蛋白的表达调控

1．1．3 血清铁蛋白

1．1．4 铁蛋白膜受体

1．2 纳米药物载体与纳米铁蛋白靶向给药系统

1．3 转铁蛋白受体1(TfR1)

1．4 阿霉素

1．5 顺铂

1．5．1 CDDP在肿瘤治疗中的作用及抗癌机制

1．5．2 肿瘤细胞对CDDP产生耐药性的机制

1．6 蛋白质组学

1．6．1 蛋白质组学的含义及其研究内容

1．6．2 蛋白质组学研究的核心技术

1．6．3 双向凝胶电泳

1．6．4 质谱技术

1．6．5 鸟枪法蛋白质组学

1．6．6 定量蛋白质组学

1．6．7 生物质谱技术

1．6．8 质量分析器的分类与串联应用

1．7 本文的研究内容与意义

2 铁蛋白H亚基的原核表达与H亚基铁蛋白的构建

2．1 材料与方法

2．1．1 材料、试剂与耗材

2．1．2 实验仪器设备

2．1．3 方法

2．2 结果与讨论

2．2．1 人铁蛋白H亚基原棱表达载体的构建

2．2．2 三种表达载体在不同浓度IPTG诱导条件下的表达情况

2．2．3 pGEX-4T-1-FTH1表达菌种的筛选和表达条件的优化

2．2．4 GST-人铁蛋白H亚基融合蛋白的表达、纯化与GST标签的切除

2．2．5 原核表达的人铁蛋白H亚基肽质量指纹鉴定

2．2．6 缺铁核人H亚基铁蛋白的透射电镜成像

2．3 小结

3 阿霉素核-H亚基铁蛋白(D-HFt)的构建及其体内外成像

3．1 材料与方法

3．1．1 材料、试剂与耗材

3．1．2 实验仪器设备

3．1．3 方法

3．2 结果与讨论

3．2．1 D-HFt的阿霉素包装量

3．2．2 D-HFt对于HepG2细胞24 h的生长抑制情况

3．2．3 FITC标记的HFt结合HepG2细胞的荧光显微镜观察结果

3．2．4 荷瘤裸鼠活体与离体成像结果

3．2．5 裸鼠异体移植人肝癌的治疗结果

3．3 小结

4 阿霉素核-H亚基铁蛋白与阿霉素抑制HepG2细胞生长的差异蛋白质组学研究

4．1 材料与方法

4．1．1 材料、试剂与耗材

4．1．2 实验仪器设备

4．1．3 方法

4．2 结果

4．2．1 肽质量指纹图谱搜索与蛋白鉴定结果

4．2．2 鉴定蛋白的GO注释结果

4．2．3 鉴定蛋白的非标记定量

4．2．4 部分差异表达蛋白mRNA转录水平的Real-time PCR检测

4．3 讨论

4．3．1 CFL1蛋白

4．3．2 STMN1蛋白

4．3．3 TBX4蛋白

4．3．4 CDC25磷酸酶与CDC25B磷酸酶

4．3．5 ELFN2蛋白

4．3．6 PDHX蛋白

4．3．7 PRDM16蛋白

4．3．8 REST蛋白

4．3．9 AKAP9蛋白

4．4 小结

5 纳米顺铂核-H亚基铁蛋白与顺铂抑制HepG2细胞生长的差异蛋白质组学研究

5．1 材料与方法

5．1．1 材料、试剂与耗材

5．1．2 实验仪器设备

5．1．3 方法

5．2 结果

5．2．1 纳米顺铂核人H亚基铁蛋白(NCC-HFt)的顺铂包装量

5．2．2 肽质量指纹图谱搜索与蛋白鉴定结果

5．2．3 鉴定蛋白的GO注释结果

5．2．4 鉴定蛋白的非标记定量

5．2．5 部分差异表达蛋白mRNA转录水平的Real-time PCR检测

5．3 讨论

5．3．1 AHSG蛋白

5．3．2 ALDOA蛋白

5．3．3 FUBP1蛋白

5．3．4 不均一性核糖核蛋白家族

5．3．5 LASP1蛋白

5．3．6 细胞角蛋白家族

5．3．7 NonO蛋白

5．4 小结

展望

参考文献

在学期间发表的论文

致谢