戊型肝炎病毒基因型间交叉优势中和表位的结构基础和功能研究

摘要

戊型肝炎（Hepatitis E，HE）是由戊型肝炎病毒（Hepatitis E virus，HEV）引起的病毒性肝炎，近年来戊型肝炎已经成为全球卫生系统的严重负担。2012年WHO最新的一份报告中指出在全世界范围内每年约有1400万例临床戊肝患者，死亡人数达到30万，并造成5200例胎儿死亡。戊肝病例的死亡率约为0.2-4％。孕妇、老年人等免疫力低下人群和已有基础性肝病的患者感染戊肝病毒后症状尤甚，其中孕妇的死亡率可以高达到20％。
　　戊型肝炎病毒是一种单链、正义的RNA病毒，分属于肝炎病毒科戊肝病毒属，基因组约为7.2kb，含有三个开放阅读框(Open Reading Frame，ORF)，其中ORF2负责编码戊型肝炎病毒唯一的衣壳蛋白，共包含660个氨基酸。戊型肝炎病毒主要有四种基因型，其中基因Ⅰ型和Ⅱ型主要感染人类及其他一些非人灵长类动物，主要通过水源传播，多呈现暴发流行;而基因Ⅲ型和Ⅳ型为人畜共患型，主要通过食源传播，常见于散发病例。虽然戊型肝炎病毒有四种基因型，但是因为ORF2所编码的氨基酸序列具有较高的同源性，并结合机体感染病毒后的临床应答情况，使得四种基因型的戊型肝炎病毒共有一种血清型，这就为戊型肝炎疫苗的研制提供了一定的理论依据，即一种疫苗可能预防所有型别病毒的感染，并且已经在中国上市的戊型肝炎疫苗Hecolin(@)的Ⅲ期临床实验结果也同样表明基于基因Ⅰ型病毒序列研制的疫苗对于预防基因Ⅳ病毒感染和发病同样具有良好的效果。
　　虽然在免疫学上多种型别的戊型肝炎病毒表现为一种血清型，而且临床实验的结果也证明疫苗的型间交叉保护效果，但是四种基因型的病毒共有一种血清型的分子机制尚未被阐明。本研究从已建立的戊型肝炎病毒单抗盘中筛选并鉴定出具有型交叉中和活性的优势单克隆抗体，通过制备不同型别的抗原抗体免疫复合物，利用X射线衍射晶体结构解析技术获得不同基因型免疫复合物的精细结构，通过多种实验手段鉴定型交叉的优势表位，从而在分子水平上阐明型交叉中和的结构基础。
　　首先，我们从戊型肝炎病毒单抗盘中筛选鉴定了一株具有型交叉反应活性的免疫优势中和单抗8G12。通过免疫印迹实验(WB)和酶联免疫吸附实验(ELISA)验证了8G12与四种型别E2蛋白一致的反应活性。通过表面等离子共振(SPR)技术测定了8G12与四种型别E2蛋白具有相当的亲和力，进一步证实了8G12的型交叉反应活性。借助体外细胞中和实验证实8G12对基因Ⅰ型和基因Ⅳ型天然戊型肝炎病毒相同的中和能力。并且通过戊肝动物模型考察了8G12对基因Ⅰ型、Ⅲ型、Ⅳ型天然戊型肝炎病毒的中和能力，结果显示8G12可以有效地中和高剂量的三种型别的病毒，通过临床检测指标发现相对于对照单抗13D4来说8G12不仅能够有效地中和病毒延缓猴体的粪便排毒大约一周的时间，并且使粪便排毒的平均持续时间缩短约2-6周，而且还可以显著地降低粪便的排毒滴度，大约平均可以降低到103.34±0.67基因组拷贝数;除此以外，所有实验组的猴体丙氨酸转氨酶(ALT)水平均正常，表示猴体并未发病，所以由以上数据可知8G12对于三种型别的病毒具有基本一致并且高效的型交叉中和活性。进而通过考察8G12对天然感染者血清、戊肝疫苗Hecolin(@)Ⅲ期临床实验中疫苗接种者血清及攻毒猴血清的阻断效果，表明了8G12在不同来源多抗血清中的优势性。
　　其次，通过抗原抗体的制备以及复合物制备条件的摸索，成功地制备了大量可用于晶体培养的复合物E2(Ⅰ)-8G12Fab和E2(Ⅳ)-8G12Fab，并且在样品制备后对样品的降解情况进行了检测，发现样品在结晶的过程中复合物中的E2蛋白会发生部分降解成为E2s蛋白，这与本课题组之前的研究结果一致。通过晶体的培养和优化最终获得了高质量的可用于X射线衍射的晶体。两种复合物晶体E2s(Ⅰ)-8G12Fab和E2s(Ⅳ)-8G12Fab最终的分辨率分别为4.0(A)和2.3(A)。通过对复合物晶体的空间结构进行分析发现，复合物中一个E2s二聚体结合两个8G12Fab分子，并且8G12Fab主要通过重链与E2s二聚体发生相互作用，维持抗原抗体的相互作用力主要是氢键，还有部分的疏水相互作用和静电相互作用，通过对相互作用界面的分析，选择了11个位于相互作用界面的氨基酸位点进行8G12所识别表位的关键位点验证，这11个位点分别为:Glu479、Arg542、Glu549、Thr553、Lys554、Thr564、Thr586、Gly589、Ala590(Ⅰ)/Ser590(Ⅳ)、Gly591、Pro592。
　　再者，本研究构建了基因Ⅰ型和Ⅳ型的定点突变克隆，所有潜在位点均突变为丙氨酸。通过WB实验表明Glu549、Lys554和Gly591突变后的E2蛋白不与8G12发生反应，分析超离(AUC)实验结果也证实三个位点突变后在溶液环境中E2蛋白不能与8G12反应形成抗原抗体复合物，实验数据显示基因Ⅰ型和Ⅳ型结果一致。同样，在p239类病毒颗粒的水平上也构建了所有位点的丙氨酸突变克隆，WB实验结果与E2蛋白的结果一致，Glu549、Lys554和Gly591这三个位点突变后的p239不与8G12发生反应;另外，ELISA实验的结果除了验证了这三个位点突变后几乎丧失了与8G12的反应活性之外，还发现三个位点Thr553、Gly589、Pro592在突变为丙氨酸后与8G12的反应活性有明显的下降。通过上述的结果表明8G12所识别的关键位点为Glu549、Lys554和Gly591，Thr553、Gly589、Pro592三个位点会减弱抗原与抗体的反应活性。
　　最后，通过比较抗体8G12与其他抗体8C11、12A10以及8G12Fab对天然病毒攻毒猴血清的阻断实验证实8G12抗体在多抗血清中的优势性，并且结合型交叉抗体8G12与型特异抗体8C11的相互阻断结果，进一步表明8G12所识别的表位在诱导机体产生免疫应答的过程中是免疫优势的。通过细胞吸附实验发现，8G12表位的双点联合突变或三点突变可以有效地降低p239类病毒颗粒对宿主细胞的吸附能力。当结合12A10表位的单点突变时，则可以使p239类病毒颗粒完全失去吸附细胞及后续入胞的能力，这就说明8G12表位在病毒与宿主细胞的相互识别的过程中起到了非常关键的作用。
　　综上所述，本研究利用结构生物学、生物化学、分子生物学和细胞生物学等方法，从分子水平上研究了戊型肝炎病毒型交叉中和表位的空间构成，阐明了不同基因型共有一种血清型的结构基础，从而有力地推动了戊型肝炎病毒基础生物学的相关研究，同时为研制一种基因型的疫苗就可以预防四种基因型病毒的感染提供了坚实的理论基础;除此之外，对戊型肝炎病毒的型交叉优势中和表位的研究有利于戊肝疫苗质量控制体系的完善，并且依据表位信息和抗体的型交叉反应活性监测戊肝病毒的逃逸株，从而为疫苗的有效性提供有力的支持和保障并为下一代疫苗的研发奠定研究基础。

目录

声明

摘要

缩略词及部分X射线衍射晶体学术语

第一章 前言

1．1 戊型肝炎概况

1．1．1 戊型肝炎病毒的发现和命名

1．1．2 戊型肝炎的历史流行情况

1．1．3 戊型肝炎病毒的传播途径

1．1．4 戊型肝炎的流行特点

1．1．5 戊型肝炎病征及并发症

1．1．6 戊型肝炎的诊断

1．1．7 戊型肝炎的治疗

1．2 戊型肝炎病毒相关研究概述

1．2．1 戊型肝炎病毒的基因组结构及其所编码的蛋白

1．2．2 戊型肝炎病毒的基因型

1．2．3 戊型肝炎病毒各基因型的地理分布

1．2．4 戊型肝炎病毒的复制周期及入胞过程的研究

1．2．5 戊型肝炎病毒的细胞培养系统

1．2．6 戊型肝炎病毒的动物模型

1．2．7 戊型肝炎病毒的结构研究

1．2．8 戊型肝炎病毒类病毒颗粒的组装

1．2．9 戊型肝炎病毒的抗原表位研究

1．2．10 戊型肝炎疫苗的研究进展

1．3 以X射线晶体学为基础的生物大分子的结构研究

1．3．1 X射线晶体学的发展历史

1．3．2 X射线晶体学相关设备的发展

1．3．3 X射线晶体学相关计算机分析技术的进步

1．3．4 晶体的表征及相关概念

1．3．5 蛋白质结晶与晶体的成核理论

1．3．6 影响蛋白质结晶的因素

1．3．7 蛋白质晶体的培养方法

1．3．8 晶体的优化生长策略

1．3．9 基于X射线衍射的晶体结构解析方法

1．4 本论文研究的思路、目的及意义

第二章 材料与方法

2．1 材料

2．1．1 主要仪器

2．1．2 质粒、菌株、病毒、细胞株及实验动物

2．1．3 常用酶及单克隆抗体

2．1．4 培养基及其他常规溶液

2．1．5 软件

2．1．6 赖氏法测定血清丙氨酸氨基转移酶所用试剂

2．1．7 分子克隆实验所用到的引物

2．2 方法

2．2．1 分子克隆

2．2．2 蛋白表达、纯化

2．2．3 蛋白的性质检测

2．2．4 蛋白的结构分析

2．2．5 单克隆抗体的制备

2．2．6 抗体Fab片段的制备

2．2．7 抗体Fab区编码基因序列的调取

2．2．8 抗原抗体复合物的制备

2．2．9 晶体培养及优化

2．2．10 X射线衍射及结构解析

2．2．11 计算机辅助设计及分析

2．2．12 基于细胞模型的细胞吸附实验

2．2．13 动物模型免疫保护攻毒实验

2．2．14 血清阻断实验

2．2．15 利用SPR技术测定抗原抗体的亲和力

2．2．16 抗体的HRP标记

2．2．17 细胞及粪便样品RNA的定性及定量检测

2．2．18 攻毒实验中猴体ALT的测定

2．2．19 攻毒实验中猴体血清总抗IgM和IgG的测定

第三章 结果与分析

3．1 戊型肝炎病毒基因型间交叉免疫优势中和抗体8G12的性质鉴定

3．1．1 抗体8G12与四种基因型的抗原蛋白E2反应活性考察

3．1．2 表面等离子共振实验测定抗体8G12与四种型别E2的亲和力

3．1．3 基于细胞模型的8G12体外中和病毒实验

3．1．4 基于疾病动物模型的8G12型交叉中和实验

3．1．5 血清阻断实验验证抗体8G12的优势性

3．1．6 第一部分小结

3．2 E2(Ⅰ／Ⅳ)-8G12Fab复合物制备、晶体培养与优化及X射线晶体结构解析

3．2．1 E2(Ⅰ)-8G12Fab复合物制备及晶体培养与优化

3．2．2 E2(Ⅳ)-8G12Fab的复合物制备及晶体培养与优化

3．2．3 E2s(Ⅰ／Ⅳ)-8G12Fab的复合物晶体X射线衍射与晶体结构解析

3．2．4 E2s(Ⅰ／Ⅳ)-8G12Fab复合物中抗原抗体相互作用界面分析

3．2．5 第二部分小结

3．3 基于复合物晶体结构的基因型间交叉表位验证及功能分析

3．3．1 E2水平上基于复合物晶体结构的型交叉表位验证

3．3．2 在p239类病毒颗粒水平上的型交叉表位验证

3．3．3 抗体8G12所识别表位的优势性

3．3．4 抗体8G12识别表位在239类病毒颗粒吸附细胞及入胞过程中的功能

3．3．5 第三部分小结

第四章 讨论

4．1 戊型肝炎病毒衣壳蛋白表面的免疫活性表位分区

4．2 戊型肝炎病毒代表性中和抗体的表位定位及其研究方法

4．3 戊型肝炎病毒型交叉中和表位与型特异性中和表位的结构比较

4．4 戊型肝炎病毒基因组所编码的蛋白

4．5 戊型肝炎病毒的类病毒颗粒

4．6 戊型肝炎病毒类病毒颗粒的结构解析及衣壳蛋白单体分区

4．7 以重组类病毒颗粒作为免疫原的预防性疫苗的开发

4．8 基于包含免疫优势表位的类病毒颗粒的戊型肝炎疫苗研发

4．9 中和表位在类病毒颗粒疫苗质量分析中的应用

4．10 戊型肝炎病毒潜在受体结合位点的研究

小结与展望

附注

参考文献

致谢

在校期间的科研成果