人参皂苷Rb1通过抑制L-型电压门控钙通道的活性改善Aβ诱导的海马神经元钙平衡紊乱

摘要

本研究拟从上述这两方面来探讨Rb1对钙超载影响的可能机制。 方法：应用全细胞膜片钳技术通过设定的不同刺激方案记录原代培养7d海马神经元上的电压门控的钙通道电流(voltage-gated calcium channel current，VGCC)。利用细胞外灌流、细胞内液给药及预孵育等给药方式，同时分别应用各型钙通道特异性阻断剂或各种蛋白激酶的抑制剂，通过比较加药前后或不同组间电流幅度的变化探讨Aβ25-35对VGCC的调控及Rb1对Aβ25-35诱导的钙内流的作用机制。预先用钙高度特异性荧光探针Fluo-3/AM负载海马神经元，进行荧光染色，利用激光扫描共聚焦显微镜观察在不同药物干预条件下海马神经元内游离钙离子荧光强度的变化探讨Aβ25-35对内质网钙库调控及Rb1对Aβ25-35诱导的内质网钙库释放的影响。 结果：(1)在原代培养的海马神经元上存在多种的钙电流成分(L、N、P/Q、T等)，它们具有各自不同的药理学及动力学特性；急性给予10μmolL-I凝聚态Aβ25-35对VGCC没有影响；10μmoIL-1凝聚态Aβ25-35预孵育3、6、12、24h后，各组电流均较对照组有不同程度的增加，并以预孵育3h记录到的高电压激活的钙电流( HVA-Ica)变化为著，而预孵育对细胞的膜电容没有影响。(2)L-型钙通道的特异性抑制剂nifedipine完全抑制了凝聚态Aβ25-35诱导的Ca2+通道电流的增加；N型钙通道特异性抑制剂ω-conotoxin GVIA及P/Q型通道特异性的抑制剂ω-agatoxin IVA均无法完全抑制凝聚态Aβ25-35诱导的Ca2+通道电流的增加。PKA抑制剂H-89部分抑制了Ap预孵育组的电流，而MAPK抑制剂PD98059无法抑制Aβ诱导的电流的增大。(3)2、10、20μM各浓度组凝聚态Aβ25-35均增加了海马神经元胞内[Ca2+]i；IP3R的特异性抑制剂2-APB明显地抑制了胞内[Ca2+]i的增加，兰尼硷受体(RyR)的特异性抑制剂dantrolene却无法抑制。Aβ25-35作用1h后内质网钙容量即有明显下降，在作用24h后降低更为明显。在无细胞外钙情况下，磷脂酶C的抑制剂U73122部分抑制了Aβ25-35诱导的胞内[Ca2+]i的增加。(4)人参皂苷Rb1可以浓度依赖性的方式抑制海马神经元上VGCC，并且抑制了Aβ25-35诱导的VGCC。Nifedipine完全阻断了之前1βMRb41对Aβ25-35诱导的VGCC的抑制，而ω-conotoxin-GVIA、ω-agatoxin IVA等作用前后1μMRb1对Aβ25-35诱导的VGCC的抑制作用没有受到影响；Rb1使Aβ25-35作用的稳态失活曲线向左即超极化方向偏移，而对Aβ25-35诱导的VGCC的激活特性没有影响；cAMP的类似物Forskolin并没有消除10μM Rb1对VGCC的抑制，Rb1对Aβ25-35诱导的VGCC的抑制率亦没有被PKA/PKC抑制剂staurosporine所影响。在无细胞外钙情况下，各浓度组Rb1不能抑制Aβ25-35诱导的细胞内钙荧光强度的增强。 结论：凝聚态Aβ25-35可通过PKA系统对细胞膜上特定的钙通道进行磷酸化调控增大VGCC。Aβ25-35可通过IP3途径产生IP3作用于IP3R而引起内质网钙的释放，磷脂酶C的活化可能参与了上述过程。人参皂苷Rb1是一种钙通道阻滞剂，它通过选择性地作用于L-型电压门控的钙通道，影响钙通道的失活过程，即通过加速通道向失活态的转化抑制通道的活性从而抑制了Aβ25-35诱导的VGCC。Rb1对Aβ25-35诱导的细胞内钙的释放没有影响。以上可能是Rb1减轻Aβ25-35诱导的海马神经元钙超载的分子机制，也是人参在抗衰老及在治疗阿尔茨海默病中发挥药理作用的细胞和分子基础。

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文摘

英文文摘

论文说明：缩略词表

声明

引 言

第一部分 凝聚态β淀粉样肽(25-35)对海马神经元电压门控的钙通道及内质网钙库的影响及其机制

材料与方法

结果

讨论

小结

第二部分 人参皂苷Rb1对Aβ25-35诱导的海马神经元电压门控钙通道开放及内质网钙库动员的作用及其机制探讨

材料与方法

结果

讨论

小结

结 论

参考文献

综述部分 综述一 神经元钙调节障碍与阿尔茨海默病

综述部分 综述二 钙蛋白酶与阿尔茨海默病的关系研究进展

致 谢

附录