急性白血病甲基化谱式分析及DNA甲基化与组蛋白甲基化修饰抑制肿瘤相关基因表达的关系

摘要

研究表明：表观遗传学异常是急性白血病发病的重要机制之一，且与白血病的发展、疗效和预后密切相关。由于表观遗传学异常的可逆性，表观遗传修饰调控被认为是一种极有前途的白血病治疗手段。但目前对急性白血病表观遗传学研究多针对单一的抑癌基因DNA甲基化或组蛋白乙酰化、组蛋白甲基化等修饰形式。对急性白血病甲基化谱式还缺乏了解，对表观遗传学不同修饰异常之间的相互作用关系、对基因表达调控机制以及表观遗传学药物治疗白血病的机制方面的研究成为近年来表观遗传学研究领域的热点。
　　本课题以急性白血病的患者和急性白血病细胞株作为研究对象，对急性白血病的DNA甲基化谱式(CpGislands methylator phenotype CIMP)进行分析，探讨DNA甲基化谱式与急性白血病患者发病和预后判断的关系。在此基础上，对急性白血病DNA甲基化和组蛋白甲基化修饰的相互关系进行初步探讨，同时对表观遗传学药物5-杂氮-2-脱氧胞嘧啶对急性淋巴细胞白血病MOLT4细胞株的细胞生物学活性、DNA/组蛋白甲基化及基因表达调控的影响和可能的作用机制进行研究。以期通过对以上内容的研究对急性白血病发病机制、预后判断及表观遗传药物靶向治疗急性白血病提供一定的理论和实验依据。
　　本研究分为以下三个部分：
　　第一部分 选取了p15、p16、p57、Id4、CDH1、CDH13、Runx3、MGMT、p14、p73、ASPP1、WIF1、SFRP1、SFRP2、SFRP4、SFRP5、DAPK、DLC-1共18个目前见报道的其异常甲基化发生可能和急性白血病或其他恶性肿瘤有相关性的肿瘤抑制基因为目的基因；分析基因甲基化在急性白血病发病中的意义，CIMP表型与急性白血病临床变量、无复发生存曲线（RFSrecurrence—free survival）及总生存曲线差异。以探讨急性白血病患者DNA甲基化谱（CIMP）与其发病和预后判断的关系。
　　第二部分 以急性白血病细胞株U937、HL60、NB4、MOLT4、Jurkat、CA46、Raji为研究对象，利用BSP+TA克隆的方法定量分析各细胞株的CIMP标志基因P15、P16、CDH1、DLC-1基因启动子区CpG岛甲基化情况；应用染色质免疫沉淀技术（CHIP-qPCR）分析不同细胞系P15、P16、CDH1、DLC-14个基因的启动子区组蛋白H3K9甲基化情况。探讨在白血病细胞系中上述4个抑癌基因启动子的不同甲基化状态与组蛋白H3K9甲基化的相关性。
　　第三部分 以急性T淋巴细胞白血病MOLT4细胞株为研究对象，研究5-Aza-CdR对MOLT4细胞的生长曲线、增殖活性、克隆形成能力、细胞周期等细胞生物学活性的影响;采用BSP+TA克隆测序和 CHIP-qPCR研究5-Aza-CdR对MOLT4靶基因DNA甲基化和组蛋白甲基化的影响；采用Real-time PCR和Western-blot法研究5-Aza-CdR对基因表达调控的影响，并分析5-Aza-CdR对DNA甲基化转移酶、组蛋白甲基化酶、HP1蛋白的表达影响，对其可能的表观遗传作用机制进行探索。
　　结论如下：
　　1.对于急性髓系白血病的患者：其P15、P16、P57、Id4、CDH1、CDH13、Runx3、P14、SFRP1,2,5、DAPK和DLC-1这13个抑癌基因启动子区CpG岛甲基化比正常人明显增高。其中DLC-1基因在AML复发组患者的甲基化率明显高于AML初治组患者。对于急性淋巴细胞白血病的患者：其P15、P16、P57、Id4、CDH1、CDH13、Runx3、P14、P73、ASPP1、WIF1、SFRP1,2,4,5、DAPK、DLC-1这17个抑癌基因的启动子区 CpG岛甲基化比正常人明显增高。这17个基因在急性淋巴细胞白血病患者初治组和复发组的甲基化率没有明显差异。急性髓系白血病患者DAPK基因的甲基化阳性率明显高于急性淋巴细胞白血病患者，而急性淋巴细胞白血病患者P73、ASPP1、WIF1、SFRP4、SFRP5这5个基因的甲基化率明显高于急性髓系白血病患者。
　　2.在急性髓系白血病患者中：①P16基因与CDH1基因；②P15基因分别与ID4基因和DLC-1基因；③CDH13基因分别与CDH1基因和RUNX3基因的甲基化存在相关性。在急性淋巴细胞白血病患者中：①P16基因、CDH1基因、SFRP1基因和DLC-1基因的甲基化存在相互的相关性；②CDH13基因分别和CDH1基因、P16基因;ID4基因和 DLC-1基因之间存在甲基化相关性。上述现象说明急性白血病中部分抑癌基因甲基化有协同现象，但目前机制未明。
　　3.CpG岛甲基化谱式（CIMP）分析对预测急性白血病的进展和预后具有重要的价值。本研究发现CIMP表型阳性的急性白血病患者其1年内复发的风险为CIMP表型阴性患者的3.184倍，其3年复发的风险为CIMP阴性的患者的2.381倍。CIMP表型阳性的患者其1年内死亡的风险为CIMP表型阴性患者的2.959倍，其3年死亡的风险为CIMP阴性患者的2.438倍。
　　4.对于急性白血病细胞株HL60、Ca46和Molt细胞，其抑癌基因P15和CDH1基因启动子区DNA甲基化与组蛋白H3K9me3甲基化水平正相关；对于急性白血病细胞株Molt4、NB4和U937细胞，其 P16基因启动子区DNA甲基化与组蛋白H3K9me3甲基化水平正相关；对于急性白血病细胞株Molt4、NB4和Raji细胞，其DCL-1基因启动子区DNA甲基化与组蛋白H3K9me3甲基化水平正相关。上述研究结果提示急性白血病抑癌基因启动子区DNA甲基化和组蛋白H3K9me3的甲基化呈正相关。
　　5.5-Aza-CdR能够通过逆转急性白血病MOLT4细胞P15、CDH1、DLC-1基因启动子区DNA和组蛋白H3K9 me3甲基化水平，使沉默的肿瘤抑制基因恢复表达，从而明显抑制急性T淋巴细胞白血病MOLT4细胞增殖；
　　6.5-Aza-CdR可能通过以下三点发挥表观遗传学调控作用：①直接抑制DNA甲基转移酶DNMT1、DNMT3a、DNMT3b和组蛋白甲基化酶SUV39h和G9a的表达来逆转DNA和组蛋白的高甲基化；②5-Aza-CdR在直接下调DNA和组蛋白高甲基化的基础上，可能通过DNA/组蛋白的循环反馈机制进一步下调DNA和组蛋白的甲基化水平；③5-Aza-CdR还可通过下调异染色质蛋白HP1的表达水平间接抑制DNA/组蛋白甲基化的反馈机制而导致DNA和组蛋白H3K9的高甲基化被逆转。

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第一部分 急性髓系/淋系白血病抑癌基因甲基化状态分析及DNA甲基化谱（CIMP）对预测急性白血病进展和预后的意义

引言

技术路线简图

材料和方法

一、材料

二、方法

结果

一、 18个肿瘤抑制基因在急性白血病患者中的甲基化情况

二、 CIMP标志基因的选取和CIMP阳性/阴性的界定

三、经PCR产物测序鉴定MSP分析的可靠性:

四、急性白血病患者CIMP标志基因甲基化相关性分析

五、CIMP标志基因单个基因的甲基化与临床变量之间的相关性分析

六、急性白血病的CpG岛CIMP表型与急性白血病患者临床变量的关系

七、CIMP表型对急性白血病患者预后影响

讨论

结论

第二部分 急性白血病细胞株CIMP标志基因（P15、P16、CDH1、DLC-1） DNA甲基化与组蛋白H3K9甲基化的相关性研究

引言

技术路线简图

材料和方法

一、材料

二、 方法

结果

一、 MSP法定性检测恶性血液病细胞株部分CIMP标记基因甲基化情况

二、BSP+克隆测序定量分析细胞株上述基因启动子区甲基化情况

三、 染色质免疫共沉淀法（Real-time CHIP qPCR）分析白血病细胞系中部分CIMP标志基因启动子区域DNA甲基化与组蛋白修饰状态的关系

讨论

结论

第三部分：5-杂氮-2-脱氧胞嘧啶对急性白血病MOLT4细胞DNA甲基化、组蛋白H3K9 甲基化状态及基因表达调控的影响及其机制

引言

技术路线简图

材料和方法

结果

讨论

结论

全 文 总 结

参 考 文 献

综述

参考文献

致谢

附录