汉族面肩肱型肌营养不良症SSLP-D4Z4-4qA/qB-PLAM基因结构特征及其与临床表型的关系

摘要

目的：面肩肱型肌营养不良症（Facioscapulohumeral Muscular Dystrophy，FSHD)是继假肥大型肌营养不良（Duchenne musculardystrophy）和强直型肌营养不良之后，第三大常见的遗传性神经肌肉疾病，发病率约为1/20000，95％病人20岁前外显。其特征性临床表现为进行性面肌，肩胛肌和上臂肌群无力和萎缩，其他部位肌肉亦可逐渐累及；除了骨骼肌系统外，还可以出现智力下降，听力受损和视网膜血管病变等。FSHD致病与4q35亚端粒区D4Z4单位拷贝数减少相连锁，超过95%病人4q35区域EcoRI酶切片段小于38kb(D4Z4单位为1-10拷贝),近年来在D4Z4上游3.5kb左右存在一段简单序列长度多肽（relatively stable simple sequence-length polymorphism），与下游4qA/4qB组成不同单倍体型，而其中某些单倍体型与FSHD致病连锁，致病连锁单倍体型中存在一段PLAM序列AT(T/C)AAAA，这段序列为DUX4稳定表达提供多聚腺苷酸信号，从而参与FSHD发病。本研究旨在总结分析汉族EcoRI片段分布情况及与临床表型的关系，分析汉族SSLP-D4Z4-PLAM基因结构区域，探讨其与FSHD致病的关系，阐释SSLP-D4Z4-PL AM基因结构区域与DUX4表达与FSHD致病之间的关系。
　　方法：⑴研究对象来自138个无亲缘关系家系的177例FSHD病人及63例血缘亲属，均来自中国汉族；男性93例，平均年龄为30.4±11.2，女性84例，平均年龄为30.5±11.4；先证者的临床诊断标准符合FSHD国际协作研究组（FSH-DY Group）制定的临床标准，并进行临床评分（Clinical Severity Scoring）评估表型。110例无亲缘关系的正常对照，均来自于汉族，男性65例，女性45例，年龄分布为25-57岁，否认遗传病家族史，所有抽血者均经过伦理委员会批准及签署知情同意书。⑵低熔点琼脂糖胶块包埋基因组DNA。基因组DNA分别经EcoR酶切，EcoRI/Bln酶切和HindIII酶切，脉冲场凝胶电泳+P13E/4qA/4qB同位素/非同位素杂交，根据结果分析EcoRI酶切片段来源（4q35/10q26亚端粒区来源），计算各EcoRI片段长度，确定片段连锁等位基因类型（4qA/4qB），观察条带有无特殊类型（易位或者嵌合现象）。⑶分析汉族FSHD病人和正常汉族人群SSLP-D4Z4-4qA/qB-PLAM分布情况。脉冲场凝胶电泳+P13E探针非同位素杂交结果，根据片段长度定位目的片段位置，胶回收目的片段DNA后利用聚合酶链反应毛细管电泳，结合4qA/4qB杂交结果。
　　结果：①138家系，致病 EcoRI片段长度为19.9±5.06kb（9kb-35kb）;70%患者在20岁之前出现临床症状，而30岁前外显占91%。主要以面肌，肩胛带肌和上臂肌群无力起病，其中不典型起病方式包括双下肢近端无力起病14例（8.6%），行走姿势异常为首发症状5例（3.1%）；在起病方式中，以面肌起病相对早。②14例为无症状携带者（或可能症状前患者），其中女性11例（包括3例女性嵌合体），男性3例，平均年龄为40.54±10岁（最小为21岁，最大56岁）；致病片段长度为19.3±3.99kb(片段最小为14kb,最大为30kb)；无症状携带者在总F SHD病人比例8.0%；在FSHD家系受累成员中比例35.6%(14/39)。③7例FSHD病人为嵌合体，其中女性4例，男性3例，嵌合体在FSHD病人中比例为4.0%。3/7例嵌合体存在4q35/10q26亚端粒区易位现象；4例女性嵌合体患者，有3例无临床症状主诉，其子女遗传了嵌合的致病短片段出现典型FSH D的临床表型，且表型明显加重。另外3例男性嵌合体患者，均出现典型 FSHD临床表现，且表型较女性为重。④除外无症状携带者，D4Z4片段大小与年龄矫正CS分数成负相关(r=－0.207，P<0.05);总体趋势是D4Z4片段越小，年龄矫正CS分数越低，提示临床表型越重。男女分开分析时，仅在男性病人中出现统计学负相关(r=-0.241，P<0.05)；考虑散发和家族变异时，在散发病例中，临床表型和年龄矫正CS分值呈较强相关性(r=－0.769,P<0.02)，跟总体相关系数比较，其相关系数绝对值明显增高。分析家族史家系先证者时，相关系数接近总体相关系数(r=－0.274 P<0.05)；起病年龄与片段大小的相关分析无统计学意义。⑤FSHD病人肌肉活检：除了肌营养不良改变外，可见不同程度炎症细胞浸润；15/50例常规心电图检查有异常，其中以不完全性右束支传导阻滞多见，比例为（14%）。9/22例行肺功能通气检查出现不同程度限制性通气功能障碍，其中4例为中重度限制性通气功能障碍，主要为临床表型比较严重病人。⑥分析80例正常汉族人群SSLP-D4Z4-4qA/4qB结构特征，4A161为4qA单体型最常见，比例为93%。4qB163为4qB型里最常见的一种单倍体型，比例为94%；10q主要有两种单体型10A166和10A164，其中10qA166约占76%,10qA164约占23%。⑦177例FSHD病人均携带4号染色体来源的4qA连锁短片段，即在所有标准带型病人中，2例(1男1女)4q35亚端粒区存在复合杂合致病类型EcoRI片段（男14-4qA/31.5-4qA、女15-4qA/35-4qA）。⑧分析138例FSHD患者致病EcoRI片段单体型，138例致病EcoRI片段均为4A161型（包括12例无症状携带）；测序验证其短片段连锁PLAM序列，均为ATTAAA;分析了其中20例10q26区域来源的短EcoRI片段(<35kb),其中18例为10A166单体型，比例约为90%，而10A164仅占2例（10%）。
　　结论：⑴汉族FSHD患者致病片段均为4qA型且都小于38kb；无证状携带者在家系受累成员中比例相对较高，占35.8%，女性多见；4q-10q高频易位可能与嵌合体形成有关，嵌合体病人的临床表型与致病片段相关性较小，而与致病片段嵌合细胞数密切相关，相当部分女性嵌合体病人无临床症状，容易被忽略漏诊。⑵患者临床严重程度与EcoRI片段长度（D4Z4缺失程度）等多因素相关。女性患者临床变异性较大，与EcoRI片段长度无统计学相关，提示女性病人患者表型受到其他表观遗传因素调控；对比家族和散发病例临床表型与D4Z4拷贝数相关性，散发病例的相关系数明显高于家族史病例，提示FSHD家系内临床异质性大于家系间。⑶汉族人群SSLP单倍体在各自4q/10q上分布相对较单一，汉族较少受到其他种族迁移的影响，种群较单一;4q35/10q26区域之间频繁易位重排，在长时间进化过程中，4q/10q上游仍保持各自SSLP单倍体型，SSLP单倍体序列在两者差异，可能是FSHD致病与4q35连锁的分子基础。⑷在正常人群中，4qA上游SSLP有其他单体型分布，而汉族FSHD病人致病短片均与4qA161PAS连锁，FSHD病人连锁这种特殊基因结构特征可能与DUX4表达相关，而后者作用下游基因发挥靶效应被认为参与是FSHD发病的重要机制之一。⑸无症状携带者的单倍体（4qA161PAS)与FSHD病人一致，表明上游的SSLP单倍体不是保护临床表型的分子基础，而是另外有表观遗传因素调控。

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英文摘要

第一部分 面肩肱型肌营养不良的4q35-D4Z4片段长度及与临床表型关系

前言

材料和方法

一、研究对象

二、主要实验材料、试剂及仪器

四、实验方法

结果

一、中国汉族人群FSHD病人EcoRI片段分布情况和临床特点

二、EcoRI片段大小与临床表型关系

三、EcoRI片段分布长度与心肺功能受累关系

讨论

第二部分 中国汉族正常人群4q35/10q26区域基因结构特征分析

前言

材料和方法

一、研究对象

二、实验材料、试剂及仪器

三. 实验方法

结果

1. EcoRI酶切片段的大小及分布特点

2. 易位和嵌合体

3. 4q35/10q26亚端粒区域各单倍体分布组成比例和分布情况

4. 4q35/10q26亚端粒区域各单倍体在不同性别（男女）分布频率和大小情况

讨论

第三部分汉族FSHD病人4q35区域SSLP-D4Z4-A/B-PLAM分析

前言

材料和方法

一、研究对象

二、实验材料、试剂及仪器

三、实验方法

结果

一、4q35/10q26亚端粒区EcoRI片段分布特点

二、4q35/10q26亚端粒区EcoRI片段易位和嵌合

三、4q35亚端粒区等位位点4qA/4qB单体型/SSLP-4qA致病片段单体型分析

讨论

参考文献

综述： 面肩肱型肌营养不良的研究进展

致谢