自噬在慢性砷诱导的人支气管上皮细胞转化中的作用

摘要

目的：
　　长期暴露于砷污染中时可以诱导多种肿瘤的发生。皮间质转化（Epithelial-mesenchymal Transition）是肿瘤发生的一个重要步骤，自噬是细胞用来对抗自身转化的自我保护机制，本文旨在探讨人支气管上皮细胞BEAS-2B经慢性亚砷酸钠诱导后，自噬在BEAS-2B转化中的作用。
　　方法：
　　1.BEAS-2B细胞处理
　　用2.5 ummol/L亚砷酸钠诱导48h为急性砷诱导；用0.25ummol/L亚砷酸钠诱导66天为慢性砷诱导；对照组 BEAS-2B相同条件无亚砷酸钠培养66天；Beclin-1shRNA质粒转染BEAS-2B细胞抑制自噬；10nM雷帕霉素作用BEAS-2B细胞24h增强自噬；10nM巴弗洛霉素A1作用BEAS-2B细胞24 h抑制自噬。
　　2.集落形成实验
　　经0.25uM亚砷酸钠暴露培养66天的BEAS-2B细胞，进行软琼脂集落形成实验，14天后显微镜下观察克隆形成情况，挑取细胞克隆消化培养为转化细胞。
　　3.自噬检测
　　Western Blot检测各组自噬标志蛋白Beclin-1，LC3Ⅱ，P62，观察自噬的活性；细胞经单丹磺酰戊二胺染色（MDC）染色,荧光显微镜观察自噬小体绿色荧光信号。
　　4.上皮间质转化（EMT）标志物和炎性体相关蛋白检测
　　调节自噬，Western Blot检测上皮细胞标志蛋白E-cadherin、间质细胞标志蛋白Vimentin、凋亡相关斑点样蛋白ASC表达。
　　结果：
　　1. BEAS-2B细胞经慢性亚砷酸钠暴露66天，克隆形成率为22.77％，较对照组（3.06%）具有显著差异（p<0.01）；
　　2.慢性砷诱导转化的BEAS-2B细胞，形态由上皮细胞的不规则多边形变为梭形；成功建立各组细胞，获得pDNA-Beclin1shRNA质粒稳定转染的细胞。
　　3.急性砷诱导组 beclin-1蛋白、LC3Ⅱ蛋白的表达最高，慢性砷诱导组beclin-1蛋白、LC3Ⅱ蛋白的表达较前者下降，但仍然高于对照组；而这两组细胞自噬降解蛋白P62的表达低于对照组。
　　4.与对照组相比，急性砷诱导组和慢性砷诱导组MDC染色显示较强的绿色荧光信号，其中急性砷诱导组荧光信号最强。
　　5.以雷帕霉素促进自噬，上皮标志蛋白E-cadherin表达增多，而间质标志蛋白vimentin表达下降；而以巴弗洛霉素A1抑制自噬后，结果正相反。
　　6.IL-1β成熟体与凋亡相关斑点样蛋白ASC的表达随着雷帕霉素促进自噬而下降，随着巴弗洛霉素A1抑制自噬而升高。
　　结论：
　　1.慢性亚砷酸钠诱导的BEAS-2B细胞形态发生改变，克隆形成能力增强，细胞发生转化；
　　2.亚砷酸钠诱导人肺支气管上皮细胞促进自噬，
　　3.自噬对ASC与IL-1β具有负调节作用，自噬对细胞转化进程起负调节作用。

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英文缩略词表

前言

第一部分 亚砷酸钠诱导肺支气管上皮细胞转化

一、 实验材料

二、 实验方法

三、 结果

四. 讨论

第二部分 亚砷酸钠诱导人支气管上皮细胞对细胞自噬的影响

一、 实验材料

二、 实验方法

二、实验结果

五.讨论

第三部分 调节自噬对砷诱导的细胞EMT和炎症因子的影响

一、 实验材料

二、 实验方法

四、 实验结果

五、 讨论

参考文献

致谢

综述

参考文献