rhBMP4促进多潜能的人牙周韧带干细胞成腱分化的实验研究

摘要

研究目标：
　　干细胞为基础的牙周再生是治疗牙周疾病引起的组织破坏的一项新颖而有效的治疗策略。牙周韧带干细胞（human periodontal ligament stem cells，hPDLSCs）是牙周再生理想的细胞来源。已知骨形态发生蛋白4（Bone morphogenetic protein-4，BMP4）具有维持牙周干细胞干性和多向分化潜能的潜能。然而，骨形态发生蛋白4在诱导牙周干细胞向肌腱／韧带方向分化上的功能犹未可知。
　　研究方法：
　　1.本研究采用酶消化法体外培养hPDLSCs。细胞的干性检测：反转录PCR检测干性指标CD-146、c-Myc、Nanog和Oct-4A，流式细胞术鉴定牙周韧带干细胞标志物STRO-1和CD146的比例。细胞分化能力检测：茜素红染色鉴定成骨分化能力，反转录PCR检测分析细胞韧带/肌腱标记物SCX、Six1、Six2和TNC。
　　2.在体外培养的hPDLSCs中添加rhBMP4蛋白、BMP4过表达质粒或rhNoggin蛋白，接着Real-time PCR检测过表达或抑制BMP4信号通路对hPDLSCs成骨分化转录因子Runx2以及肌腱发育的标志基因Tenascin C（TNC）、Collagen1α1（COL1α1)和Collagen1α2(COL1α2)转录水平的变化，Western Blot检测其Runx2和TNC的变化。
　　3.随后通过对肌腱特异性转录因子Scleraxis（SCX）mRNA和蛋白质表达水平以及细胞免疫荧光对表达位置的分析，结合搜索STRING数据库中BMP4与SCX的关系，同时利用VISTA软件分析SCX启动子上是否有Smad的结合位点。
　　研究结果：
　　1. hPDLSCs细胞表达干细胞标记基因、腱性标记物以及具有骨向分化潜能：第三代hPDLSCs中CD146和STRO-1阳性表达百分比分别为65.26％和7.14%。内源性干性基因RT-PCR显示c-MYC和OCT-4A表达量与CD146接近，Nanog荧光较低。hPDLSCs经过三周成骨诱导液诱导和茜素红染色可见明显的钙化结节。内源性成腱基因的RT-PCR显示其较高表达SCX和Six2，而Six1和TNC表达较弱。
　　2. rhBMP4增加hPDLSCs中Runx2 mRNA和蛋白的表达：rhBMP4（10ng/ml,100ng/ml）对Runx2 mRNA表达的促进呈时间依赖关系，处理后第一天开始出现，第三天变化明显，而第七天未见明显差异。rhNoggin(BMP4的拮抗剂)（1拮抗剂gg）处理后的第一天对Runx2的表达水平没有明显影响，在第三天降低了表达水平。更进一步地，蛋白质定量分析实验同样证明了rhBMP4（10ng/ml）处理1天后促进hPDLSCs细胞核内Runx2蛋白水平的表达。
　　3. BMP4促进hPDSCs中TNC的表达并依赖于细胞外基质浓度：rhBMP4(10 ng/ml,100 ng/ml）处理之后的第一天，TNC mRNA的表达水平明显增加。同样地，利用lipofectamine2000包裹BMP4过表达质粒pNL-BMP4-IRES2-EGFP转染hPDLSCs一天后，也在蛋白质水平上增加TNC的表达。Westernblot的分析结果表明，高浓度的CollagenⅤ促进hPDLSC中TNC蛋白的表达水平，BMP4在高浓度的CollagenⅤ（3mg/ml）环境下对TNC的表达水平有明显促进作用。BMP4在低浓度的CollagenⅤ（1.25mg/ml）环境下，对TNC蛋白的表达水平没有促进作用。
　　4. BMP4维持hPDLSCs细胞外基质胶原蛋白基因的表达：反转录PCR的结果显示，在BMP4和Noggin处理后的第一天，ColIα1和ColIα2两个基因的表达水平都没有明显变化。但是在处理之后第三天，对照组，高浓度BMP4组（100 ng/ml）和Noggin组（1 ng/ml），ColIα1和ColIα2的表达水平都降低，只有低浓度BMP4（10 ng/ml）组还维持着可见的ColIα1和ColIα2维持着基因表达.
　　5. BMP4增加hPDLSCs中SCX mRNA和蛋白的表达：BMP4蛋白对SCX的促进成时间依赖关系，在处理之后第一天开始出现，处理之后第三天变化明显，处理之后第七天变化不明显。Noggin（1ug/ml）处理之后的第一天对SCX的表达水平没有明显影响，在处理之后的第三天降低SCX的表达水平。更进一步地，蛋白质的定量分析实验同样证明了BMP4蛋白促进hPDLSCs细胞核内SCX蛋白的表达。
　　6. BMP4蛋白诱导SCX的核向定位：低浓度BMP4（10 ng/ml）处理之后6小时的hPDLSC中，SCX在细胞核内的定位显著增加，细胞质内的定位减少。量化结果显示，对照组中核内SCX蛋白占总量的43%，BMP4使SCX的核内定位提高到72%。
　　7. STRING数据库和VISTA软件分析表明SCX转录起始位点上游存在有Smad和Smad3的结合位点。
　　研究结论：
　　rhBMP4能瞬时地诱导SCX的核内定位，增加肌腱相关基因和/或蛋白SCX，Tenascin C，Collagen1α1和Collagen1α2的表达，初步揭示BMP4促进hPDLSCs成腱分化的可能机制。

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前言

第一部分 hPDLSCs的干性和多向分化潜能鉴定

材料与方法

结果

讨论

第二部分 rhBMP4对PDLSCs分化潜能的影响

材料与方法

结果

讨论

第三部分 rhBMP4促进hPDLSCs成腱分化的机制探析

材料方法

结果

讨论

结论

参考文献

综述题目：BMPs信号通路在牙周支持组织再生中的作用

致谢