免疫负性调控因子PD-1在鼻咽癌患者PBMC中的表达情况以及γδT淋巴细胞,NK细胞,NKT淋巴细胞体外杀伤鼻咽癌细胞株的作用比较

摘要

目的：PD-1（Programmed death-1，程序性死亡分子1）是T淋巴细胞处于免疫抑制状态的标志，T淋巴细胞表面PD-1分子的过高表达会影响其增殖能力和杀伤活性。通过检测鼻咽癌肿瘤患者PBMC（peripheral blood mononuclear cell,外周血单个核细胞）中PD-1分子的表达情况，分析其与患者临床分期的相关性，探讨其作为评估鼻咽癌肿瘤患者临床预后的指标可行性；通过抽取鼻咽癌患者外周血培养三种淋巴细胞：NKT淋巴细胞、γδT淋巴细胞、NK淋巴细胞杀伤鼻咽癌细胞系CNE-1的杀伤作用比较，筛选出杀伤作用较强的淋巴细胞种类，讨论将PD-1单克隆抗体封闭不同种类具有杀伤作用的淋巴细胞表面上的PD-1分子是否对鼻咽癌细胞系杀伤作用产生不同影响。
　　方法：用流式细胞仪检测53例鼻咽癌患者和58例健康人的PBMC表面PD-1的表达情况，分析PD-1分子的表达与CD3+CD8+细胞毒性T淋巴细胞和CD3+CD4+记忆性T细胞相关性以及临床分期的的相关性，对鼻咽癌患者的细胞免疫状态进行初步的评估，同时从鼻咽癌患者外周血分离PBMC细胞，利用GM-CSF、IL-4等细胞因子培养DC（Dendritic cell，树突状细胞），用α-Galcer、anti-CD3mAb、IFN-γ、IL-2等细胞因子体外扩增培养γδT淋巴细胞，NK细胞，NKT淋巴细胞三种淋巴细胞，将γδT淋巴细胞以及NKT淋巴细胞与鼻咽癌肿瘤抗原预激的DC共孵育，最终发展为抗原预激特异性T细胞，利用无标记追踪法比较三种淋巴细胞杀伤鼻咽癌细胞株CNE-1的情况，筛选出杀伤作用较强的淋巴细胞，后加入抗PD-1单克隆抗体阻断T淋巴细胞表面PD-1分子的表达，检测阻断后T淋巴细胞的增殖情况和细胞表面PD-1分子的表达情况。最后用无标记追踪法检测比较杀伤能力最强的T淋巴细胞阻断前后对鼻咽癌细胞株CNE-1的特异性杀伤活性的差异。
　　结果：(1)鼻咽癌患者PBMC中的PD-1的表达率明显高于健康人（P<0.0001），但与鼻咽癌临床分期没有明显的统计学差异。(2)PD-1的表达与CD3+CD8+CTL （cytotoxic lymphocyte,细胞毒性T淋巴细胞）以及CD45RO+CD62LˉTEM（effector memory T cell，效应记忆性T细胞）的含量呈负性相关（P<0.0001）。(3)无标记追踪法杀伤实验显示NKT淋巴细胞为三种淋巴细胞中杀伤鼻咽癌肿瘤细胞系CNE-1能力最强，NK淋巴细胞次之，γδT淋巴细胞最弱（P＜0.05）(4)抗PD-1单克隆抗体对NKT淋巴细胞的增殖活性无明显影响（P>0.05），但NKT细胞表面PD-1的表达明显下降（P<0.0001）。(5)无标记追踪法杀伤实验显示:PD-1阻断组的NKT淋巴细胞对肿瘤细胞株CNE-1的杀伤活性高于对照组，差异有统计学意义（P<0.05）。
　　结论：（1）PD-1在鼻咽癌肿瘤患者PBMC中的平均表达率高于健康人PBMC中的表达，PD-1的高表达一定程度上反应了患者T淋巴细胞功能抑制的状态，通过流式细胞术检测鼻咽癌患者PBMC中PD-1的表达可以作为临床应用抗PD-1单克隆抗体治疗的评估指标。（2） PBMC中PD-1的表达与鼻咽癌患者分期并无统计学相关，并不能作为判断鼻咽癌患者预后的判断指标。（3）体外阻断过继性NKT淋巴细胞表面PD-1分子的高表达可以有效提高其体外杀伤鼻咽癌细胞系CNE-1能力，抗PD-1单克隆抗体与过继性NKT细胞联合应用有望能成为鼻咽癌免疫治疗的新途径。

目录

声明

前言

材料与方法

1 主要实验对象与材料

2 实验方法与步骤

3 入组病人资料

4 统计学处理

结果

1 流式细胞术检测PBMC的PD-1表达与淋巴细胞亚型及其临床分期的相关性

2 鼻咽癌患者PBMC培养淋巴细胞杀伤实验及相关表型检测

讨论

1 PD-1的表达与鼻咽癌患者机体的免疫状态的关系

2 NKT淋巴细胞，γδT淋巴细胞以及NK细胞的杀伤作用比较。

3 PD-1的表达对NKT淋巴细胞杀伤活性的影响

4 PD-1单克隆抗体与过继性NKT细胞免疫疗法联合应用于鼻咽癌的临床意义

结论

参考文献

综述:T淋巴细胞在肿瘤治疗应用中所面对的挑战与前景

致谢