腺相关病毒介导HO-1基因转移对大鼠脊髓损伤保护作用的实验研究

摘要

目的：
　　1.构建腺相关病毒（Adeno-associated virus,AAV）载体介导的大鼠血红素加氧酶-1（Heme oxygenase-1,HO-1）重组过表达病毒（AAV-HO-1）并利用其转染大鼠脊髓组织；
　　2.探讨AAV-HO-1对大鼠脊髓损伤（Spinal cord injury,SCI）的保护作用；
　　3.探讨AAV-HO-1对大鼠SCI保护作用的机制。
　　方法：
　　1.构建HO-1过表达的重组腺相关病毒载体；
　　2.按不同处理因素将动物分为假手术组（Sham组）、单纯 SCI组（SCI组）、空载体组（AAV-EGFP组）和AAV-HO-1组，于脊髓损伤模型建立前7d，向SCI组、AAV-EGFP组和AAV-HO-1组大鼠局部脊髓组织分别注射生理盐水、AAV空载体（AAV-EGFP）和AAV-HO-1进行预处理，采用重物压迫脊髓损伤模型，于SCI前和SCI后1d、3d、7d、14d和21d等6个时间点通过Basso Beattie Bresnahan（BBB）评分观察大鼠后肢运动功能，评价过表达HO-1对SCI的保护作用；
　　3.丙二醛（Malondialdehyde,MDA）和超氧化物歧化酶（Superoxide Dismutase,SOD）试剂检测脊髓组织损伤后MDA含量、SOD活性的变化情况；应用蛋白质印迹（Western blot）技术检测HO-1、Bax和Bcl-2表达情况；脱氧核糖核苷酸末端转移酶介导的缺口末端标记法（TdT-mediated UTP nick end labeling,TUNEL）检测脊髓组织细胞凋亡情况；荧光显微镜观察各组脊髓组织荧光信号表达情况；免疫荧光染色法检测脊髓组织中神经元核心抗原（Neuronal nuclear antigen,NeuN）阳性细胞表达情况。
　　结果：
　　1.成功构建HO-1过表达重组腺相关病毒载体；
　　2.成功建立重物压迫脊髓损伤模型，SCI组、AAV-EGFP组和AAV-HO-1组的BBB评分与Sham组相比显著下降，AAV-HO-1组在损伤后7d、14d和21d的BBB评分与SCI组和AAV-EGFP组相比显著增加，差异有明显统计学意义（P＜0.05）；
　　3.AAV-HO-1组与SCI组和AAV-EGFP组相比，NeuN阳性细胞明显增加，差异有明显统计学意义（P＜0.05）；
　　4.将AAV-HO-1成功转染至大鼠脊髓组织中，并能在脊髓组织中持续高水平表达HO-1；
　　5.AAV-HO-1组与SCI组和AAV-EGFP组相比，细胞凋亡指数（Apoptosis index,AI）及Bax蛋白水平显著降低，Bcl-2蛋白水平明显升高，差异有明显统计学意义（P＜0.05）；
　　6.AAV-HO-1组与SCI组和AAV-EGFP组相比，MDA含量显著减少，SOD含量显著增多，差异有明显统计学意义（P＜0.05）。
　　结论：
　　1.过表达HO-1能促进SCI大鼠脊髓神经元存活和肢体运动功能恢复，对SCI有保护作用；
　　2.过表达HO-1能抑制大鼠脊髓组织细胞凋亡，挽救受损脊髓组织，利用过表达HO-1的抗凋亡作用发挥保护作用；
　　3.过表达HO-1能减少细胞内活性氧，抑制氧化应激反应，利用过表达HO-1的抗氧化作用发挥保护作用。

目录

声明

英文缩略词表

前言

第一部分HO-1重组腺相关病毒的构建

一 材料与方法

二 结果

三 讨论

四 小结

第二部分 AAV-HO-1对大鼠SCI的保护作用及机制研究

一 材料与方法

二 结果

三 讨论

四 小结

参考文献

综述:脊髓损伤的基因治疗研究进展

致谢