隐丹参酮、丹参酮ⅡA对SD大鼠睑板腺上皮细胞增殖、分化及脂质合成的影响

摘要

目的：观察不同浓度的丹参酮两种主要的单体成分隐丹参酮、丹参酮ⅡA对体外原代培养的SD大鼠睑板腺上皮细胞增殖、分化及脂质合成的影响；探讨丹参酮用于临床治疗睑板腺功能障碍（Meibomian Gland Dysfunction, MGD）的可行性及其作用机制。
　　方法：运用单细胞消化法，取SD大鼠睑板腺组织用Ⅳ型胶原酶消化并吹打成单个细胞后，与3T3细胞一起进行体外原代细胞培养，取培养7天左右已有克隆形成的原代细胞，实验组分别加入浓度为0.125、0.25、0.5、1.25、2.5、5.0umol/L的隐丹参酮、丹参酮ⅡA，对照组加入5.0umol/L的DMSO，继续培养48h后，用结晶紫染色和油红染色检测睑板腺上皮细胞的克隆形成率和脂质合成情况，实时荧光定量PCR检测KRT16（角蛋白16），Ki67（细胞增殖相关抗原）以及C/EBPα（CCAAT增强子结合蛋白）的表达。
　　结果：1、原代培养的睑板腺细胞在倒置显微镜下观察，第4-5开始有克隆形成，在6-7天时克隆细胞数量呈指数形式增长；2、PCR检测结果：（1）浓度为0.125、0.25、0.5、1.25、2.5、5.0umol/L的隐丹参酮作用于睑板腺细胞48h后，其K16基因相对表达量，实验组各浓度的K16表达量较对照组均有升高，浓度为1.25umol/L组与对照组相比差异有统计学意义（p=0.001，p＜0.05），其余浓度对应组与对照组相比较均没有统计学意义（p值分别为p1=0.784, p2=0.761, p3=0.276, p5=0.128, p6=0.963, p＞0.05）；Ki67基因的相对表达量，0.125umol/L组比对照组下降，余各浓度组较对照组均有升高，其中仅浓度为0.5，1.25umol/L组比对照组差异有统计学意义（p3=0.001, p4=0.000，p＜0.05）；C/EBPα的相对表达量；实验组中各浓度的C/EBPα表达量较对照组均有升高，但与对照组相比较差异均没有统计学意义(p＜0.05)。（2）浓度为0.125、0.25、0.5、1.25、2.5、5.0umol/L的丹参酮ⅡA处理48小时后其Keratin16的相对表达量，实验组各浓度的K16表达量较对照组均有升高，其中仅浓度为0.5，1.25umol/L组相比对照组差异有统计学意（p1=0.042, p2=0.043，p＜0.05），其余各组与对照组相比较均没有统计学意义（p＞0.05）；Ki67的相对表达量0.125umol/L的丹参酮ⅡA处理组Ki67基因的表达量相比对照组下降，其余各浓度组较对照组均有升高，其中仅浓度为0.5，1.25umol/L组相比对照组差异有统计学意义（p1=0.001, p2=0.000，p＜0.05），其余各组与对照组相比较差异均没有统计学意义（p＞0.05）;（3）C/EBPα的相对表达量，实验组各浓度实验组的 C/EBPα表达量较对照组均有升高，但各个浓度对应的 C/EBPα表达量与对照组相比较差异均没有统计学意义（p＞0.05）；3、油红染色结果：不同浓度药物的实验组与对照组相比较，睑板腺细胞油红染色结果都为阴性，细胞中均未见脂质合成，细胞不同克隆边缘交界处细胞团或可出现油红染色阳性，呈堆积状，考虑脂滴来自与睑板腺细胞共同培养的3T3细胞；4、克隆形成率：DMSO对照组睑板腺细胞的平均克隆形成率为2.05%，1.25umol/L隐丹参酮处理组睑板腺细胞的平均克隆形成率2.55%，高于DMSO对照组，（p=0.041, p＜0.05）差异具有统计学意义；1.25umol/L丹参酮ⅡA处理组睑板腺细胞的平均克隆形成率2.25%，略高于DMSO实验对照组，（p=0.429, p＞0.05），差异不具有统计学意义。
　　结论：丹参酮的两种主要单体成分隐丹参酮、丹参酮ⅡA可以促进睑板腺细胞增殖及体外克隆的形成，但不影响睑板腺上皮细胞的分化及脂质合成。

目录

声明

主要英文缩略词表

前言

一 材料

1. 1 实验动物

1.2 主要试剂、耗材

1.3 主要仪器名称

1.4 主要试剂配制：

二 方法

2.1 3T3细胞系的复苏、培养及冻存

2.2 睑板腺组织的分离

2.3 睑板腺细胞与3T3细胞系共同培养

2.4 睑板腺细胞的K14和P63免疫荧光染色

2.5 加药：

2.6 睑板腺细胞RNA的提取以及逆转录

2.7实时荧光定量PCR（RT-qPCR）反应体系及反应条件

2.8 油红染色：

2.9结晶紫染色

2.10统计学处理：

三 结果

3.1 睑板腺组织块的分离

3.2睑板腺细胞的原代培养

3.3 大鼠睑板腺组织与培养的睑板腺细胞的K14和P63 荧光染色结果

3.4 荧光定量PCR的结果

3.5 油红染色结果

3.6 睑板腺细胞克隆形成率

四 讨论

五、结 论

参考文献

综述:睑脂成分改变对泪膜表面张力影响的研究进展

致谢