橄榄树内生菌分离及其耐有机溶剂脂肪酶研究

摘要

脂肪酶是一类酯键水解酶。它除了催化油脂水解反应外,还可催化酯化反应、转酯化反应、酯的酸解、酯的醇解和酯的氨解等多种类型的反应。在催化过程中,脂肪酶表现底物特异性、化学选择性、区域选择性和对映体选择性等特性,已被广泛应用于精细化工、洗涤、医药、食品、造纸、皮革加工、纺织、饲料和生物柴油等领域,成为最有经济价值的生物催化剂之一。在实际应用和不同的工业生产过程中,对脂肪酶分子稳定性、底物选择性和催化活性等要求各不相同,需要众多不同类型的脂肪酶提供选择。因此,不同来源脂肪酶产生菌分离及其合成的不同类型酶分子研究始终是研究热点之一。
　　 本文基于微生物生态学分离策略,选择分离油脂和有机物质含量较为丰富的橄榄树内生、共生和附生微生物。共分离到118个脂肪酶产生菌株,其中75株细菌,25株酵母菌和18株霉菌。分离菌株中分别有9株细菌,4株酵母菌和5株霉菌产生的脂肪酶不仅具有水解能力,还具有耐有机溶剂和催化酯合成能力。其中细菌菌株B18和B22产生的脂肪酶粗酶液酶活较高,并具有较高的有机溶剂耐受能力。经16srDNA鉴定分别为肠杆菌属和柠檬酸杆菌属,这两个属均为常见的内生菌。两个菌株编号分别为Entrobacteria sp.FN301和Citrobacter sp.FN302。
　　 蛋白质纯化是进一步研究纯酶性质的前提。Citrobacter sp.FN302菌株发酵液通过超滤浓缩、DEAE Sepharose Fast Flow离子交换层析和Sephacryl S-100凝胶层析后,得到了电泳纯的脂肪酶CFL302。SDS-PAGE电泳估算其表观分子量约为40KDa。对其酶学性质研究发现:CFL302是一种耐热、耐有机溶剂脂肪酶。最适作用温度在45℃,40℃～60℃内有较好的催化活性;35℃～65℃该酶的稳定性较好；最适作用pH约为7.0,且pH在4.0～9.0时较稳定；对有机溶剂的耐受性较好,在丙酮、正庚烷、正己烷、异辛烷、苯和二甲苯中酶活均比纯水相有所提高；10mmol/L的Ca2+和Mg2+对CFL302的酶活力有促进作用,其中Ca2+促进作用最大；Tween20、Tween80和Urea对酶活力具有提高的作用；CFL302对C链长度小于或等于12的短链脂肪酸形成的甘油三酯具有较强的水解能力。本文还对CFL302酶蛋白质进行N端测序,获得其N端12个氨基酸序列为:N-I-S-C-C-C-R-E-K-P-G-I,与NCBI数据库中蛋白序列比对未找到与之同源的脂肪酶基因序列,该脂肪酶来源、结构和性质较为特殊,很可能是一种新的脂肪酶,具有进一步研究价值。
　　 为了获得更大量的纯酶,培养基优化是一条重要途径。本文通过单因素试验结合响应面设计分析,确定Citrobacter sp.FN302菌株优化后的产酶培养基为:麦芽糖0.93％、酵母膏1.8％、橄榄油乳化液2.9％、硫酸镁0.12％,磷酸氢二钾0.12％,初始pH值7.5、接种量5％,30℃培养,转速230 rpm,发酵24h。优化后Citrobactersp.FN302菌株发酵液酶活从1.5U/ml提高至6.2U/ml,提高了4.13倍。
　　 通过提取FN302基因组DNA,Sau3AI部分酶切,回收1～5Kb大小的DNA片段,与经BamHI酶切的pUC18载体连接,转化E.coli DH5α感受态细胞,构建了FN302菌株基因组文库,为进一步从该菌中克隆编码脂肪酶基因奠定了基础。