蜜蜂球囊菌cDNA文库的构建及胞外酶的定性研究

摘要

蜜蜂白垩病(bee chalkbrood disease)是由蜜蜂球囊菌(Ascosphaera apis)引起的真菌性传染病，主要感染蜜蜂幼虫。白垩病是我国养蜂业中潜在病害之一，影响着我国养蜂业的发展。目前国内外对蜜蜂球囊菌的研究主要集中在病原的生物学特性、最适培养条件、发病流行规律、病理学、病情的诊断等方面，由于蜜蜂球囊菌的致病机理不明，不能在生产中有效的预防和治疗蜜蜂白垩病。 本研究采用Stratagene公司的ZAP Eepress R cDNA Synthesis Kit and ZAP Express R cDNA Gigapack R III Gold Cloning Kit试剂盒，构建了蜜蜂球囊菌cDNA文库。文库滴度测定为106 pfu·mL-1，扩增后的滴度是109 pfu·mL-1；噬菌体的转化后，蓝白斑筛选单菌落，重组率达到90％。这为后续工作的进行打下良好的基础。昆虫中肠围食膜主要由蛋白质、几丁质和糖类等组成。蜜蜂球囊菌通过分泌胞外蛋白酶、几丁质酶、酯酶和淀粉酶等破坏蜜蜂幼虫中肠围食膜侵染蜜蜂；本试验对几种常见的蛋白酶、酯酶和淀粉酶分别进行活性染色和银染，结果显示：蜜蜂球囊菌能够胞外分泌蛋白酶、酯酶和淀粉酶。在SDS-PAGE条件下，蛋白酶活性染色有两条条带，分子量为37.0 kDa和110.0 kDa；酯酶活性染色鉴定出三条带，分子量是14.1 kDa、20.1 kDa、29.0 kDa。在PAGE条件下，蛋白酶有两条条带，分子量为48.0 kDa和94.0 kDa；酯酶活性鉴定出一条带，分子量是35.0kDa淀粉酶活性鉴定出至少三条带，分子量为90.0 kDa、97.2 kDa和大于97.0 kDa。 此外，本研究还对球囊菌分泌几丁质酶的情况进行了探索。利用蜜蜂球囊菌胞外分泌物(几丁质结合蛋白)结合胶体几丁质(N-乙酰葡糖氨)，设计不同结合时间、不同缓冲体系，进行结合蛋白试验，然后结合后进行Loading buffer和Calcofluor(M2R)处理；pH 7.4条件下结合6 d，Loading buffer处理的效果好，同时得出Loading buffer比Calcofluor(M2R)处理效果好。

目录

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摘要

第一部分　文献综述

1蜜蜂白垩病研究进展

1.1病原学研究进展

1.2培养条件的研究

1.3流行病学的研究进展

1.4白垩病预防与疾病防治研究进展

2昆虫围食膜(PM)的研究进展

2.1PM的发现

2.2PM的形成

2.3PM的组成成分

2.4PM的结构

2.5PM的功能

3研究目的与意义

第二部分　蜜蜂球囊菌cDNA文库的构建

1试验材料

1.1试验菌种

1.2主要试剂

1.3主要仪器

1.4主要溶液配制

2试验方法与步骤

2.1菌种的培养

2.2蜜蜂球囊菌总RNA的提取

2.3mRNA试剂盒的分离纯化

2.4cDNA文库的构建

2.5文库的体外切割

2.6小量质粒提取（UNIQ-10柱型质粒小量抽提试剂盒）

2.7PCR方法鉴定插入片断大小

3结果

3.1蜜蜂球囊菌的总RNA质量鉴定与定量cDNA

3.2cDNA文库的分级分离

3.3cDNA文库滴度

3.4质粒及PCR检测结果

4小结

第三部分蜜蜂球囊菌胞外酶的定性研究

1试验材料

1.1菌株

1.2主要试剂与配制

2试验方法

2.1菌种的培养

2.2粗酶液的制备与浓缩

2.3胶体几丁质制备

2.4SDS-PAGE和PAGE配制

2.5蛋白浓度的测定

2.6蜜蜂球囊菌主要胞外蛋白酶的活性染色和银染鉴定

2.7结合试验步骤

2.8银染色步骤

2.9考马斯亮蓝染色步骤

3结果

3.1蛋白浓度测定

3.2蜜蜂球囊菌胞外蛋白酶、酯酶和淀粉酶的鉴定

3.3几丁质结果蛋白实验

4小结

第四部分　讨论

参考文献

致谢

附录 英文缩略词表