禽(番鸭)呼肠孤病毒TaqMan探针荧光RT-PCR诊断方法的建立及应用

摘要

番鸭呼肠孤病毒感染是近几年在中国福建、浙江、江苏、广东等中国南方番鸭饲养区出现的一种新的番鸭疫病，又称为番鸭肝白点病，俗称“肝白点病”或“花肝病”，是一种以软脚为临床特征的急性传染病。其发病率和死亡率较高，给番鸭养殖业造成了严重的经济损失。因此，建立一种切实可行且快速的诊断方法越来越受到国内外水禽养殖业的关注。 本课题以本实验室分离鉴定保存的番鸭呼肠孤病毒YB分离株为研究材料，采用TaqMan探针法，建立了针对番鸭呼肠孤病毒的实时荧光RT-PCR诊断方法并进行了初步应用。本试验研究包括： 1.对实时荧光RT-PCR诊断方法反应条件的优化 用番鸭胚扩增病毒，提取病毒核酸，用该核酸对反应的条件进行优化。通过试验表明，退火/延伸温度用57℃，上游引物和下游引物终浓度都为0.7uM，TaqMan探针的终浓度为0.5uM时，可以获得较佳的CT值及DeltaRn值。 2.标准品的制备及重复性试验 将RT-PCR所得到的目的片段切胶回收后，将回收片断连接PMD18-TVector，再将连接产物转化到DH5α感受态细胞，培养重组菌，然后提取重组质粒。该重组质粒可做为该诊断方法的标准阳性对照，且重组菌易于保存，重组质粒容易获得，这样比保存病毒更为方便。测出重组质粒的浓度及其拷贝数，将其稀释到1.0×1010，做为标准品保存。将该标准品10倍稀释后，选取3个浓度的标准品，每个浓度做4次重复试验验证该方法的稳定性，试验结果表明其变异系数较小，稳定性良好。 3.标准曲线的构建 将标准品10倍稀释后选取5个浓度梯度，每个梯度做4个重复，做出标准曲线。标准曲线的斜率(Slope)为-3.1，相关系数(R2)为0.994，该标准曲线的相关性较好。 4.应用 该诊断方法的灵敏度较高，至少能检测到100拷贝/uL的标准品，比普通的PCR灵敏度高100倍。通过对该方法的特异性试验表明，该诊断方法不受鸭其它常见病毒的干扰。通过人工攻毒雏番鸭，对其肝脏组织进行检测，检出率达到100％。应用该诊断方法也能对临床采集的样品进行检测。

目录

文摘

英文文摘

声明

文献综述

一：禽(番鸭)呼肠孤病毒

1呼肠孤病毒的研究现状

2病毒的理化特性

3分子生物学特性

4病毒的致病性

5禽(番鸭)呼肠孤病毒的研究现状

6禽呼肠孤病毒的诊断

7 防治

二：实时荧光定量PCR(real-time fluorescence quantitive PCR.real-time FQ-PCR)

1 FQ-PCR的原理

2两个重要的概念

3荧光标记与探针类型

三：番鸭呼肠孤病毒病的危害及本研究的目的

实验研究

1材料

1.1番鸭与番鸭胚

1.2毒株

1.3主要试剂及仪器

2实验方法

2.1引物及探针的设计与合成

2.2病毒的扩增

2.3病毒核酸的提取

2.4反应条件的优化

2.5标准品的制备

2.6重复性、稳定性试验

2.7标准曲线的制作

2.8灵敏度及特异性试验

2.9该诊断方法的应用

3结果与分析

3.1反转录前病毒核酸的不变性与变性的比较

3.2反应退火温度的选择

3.3引物和探针的最佳配比浓度(终浓度)

3.4重组质粒的提取及鉴定

3.5重复性、稳定性试验

3.6标准曲线的建立

3.7灵敏度试验

3.8特异性试验

3.9攻毒番鸭肝脏组织中病毒核酸的检测

4.0临床样品的检测

4讨论

结论

致谢

参考文献：