GCC盒、D盒、JERE盒和JEGC盒在水稻中的功能分析

摘要

在自然界中，植物经常受到各种病原菌、病毒和线虫的危害，而且其危害严重影响着农作物的产量和品质。培育对病虫害具有高效和持续广谱抗性的农作物目前成为植物学研究的主要方向之一。过去人们通过传统分子标记辅助育种方法获得抗性品种或施用杀虫剂来减少病虫害对作物的危害。上述两种方法都不能持久有效对病虫害进行控制，因为随着品种种植时间增加容易导致抗病基因的失效，或施用化学杀虫剂容易造成残留而且不可避免的对环境造成危害。近年来，随着在分子生物学水平上对植物与病原菌的相互作用和植物防卫反应的大量研究。人们尝试着通过转基因的手段，获得对病原菌具有持久抗性的植物。但是由于驱动目的基因表达启动子的特性，实验未能取得令人满意的结果。
　　 在植物抗病基因工程中通常采用CaMV35S、Actin-1和Ubiquitin等组成型启动子驱动单一抗病基因表达的策略。获得的转基因植株能够增强对病原菌的抗性而且也能够使植物适应不利环境。但是，组成型表达是以消耗植物体内过多的能量和物质为代价，容易破坏植物体内代谢平衡。许多实验结果显示，组成型表达的转基因植株具有许多异常特征。例如生长速度改变、形态畸形以及发育和成熟时间的改变，甚至在无病原菌侵染的生长条件下表现出抗病反应的特征等。
　　 所以我们尝试着人工构建诱导型启动子，使其在转基因植株中仅在病原菌侵染部位驱动目的基因表达，同时可以随着外源胁迫的解除，停止表达目的基因，在正常生长条件下将减少植物体内能量和物质的消耗。近年来，实验证明运用合成启动子技术构建的新型诱导型启动子能有效调控目的基因的表达。构建病原菌诱导型启动子，可以运用模式植物中大量己知的能响应病原菌侵染基因的启动子中关键顺式作用元件作为目标元件。
　　 在本研究中，我们采用存在于能被乙烯诱导表达基因和病程相关蛋白基因启动子中的GCC盒，其核心序列为AGCCGCC。应答茉莉酸和激发子的GCC类似元件JERE盒，其核心序列为AGACCGCC。D盒，来自于欧芹PR2基因启动子中大约-76～-52bp区域，序列为TACAATTCAAACATTGTTCAAACAAGGAACC，其核心序列未知。以及一个由GCC盒与JERE盒串联组成的组合元件，在本研究中命名为JEGC盒。运用2倍的上述元件分别与CaMV35S核心启动子融合构建成病原菌诱导型启动子再与gus报告基因相连，运用农杆菌介导目的基因对水稻愈伤组织进行遗传转化，获得转基因植株，套袋，自交获取种子。对其T1代植株进行稻瘟病侵染、稻纵卷叶螟取食和机械损伤处理等生物胁迫处理，以及对T1代种子萌发的幼苗和所诱导的愈伤进行高盐、干旱、低温、高温、重金属、紫外照射等非生物胁迫处理和喷洒外源激素乙烯利、脱落酸、茉莉酸甲酯和水杨酸类似物苯并噻二唑等处理。通过组织化学染色检测启动子在各种处理后所介导gus基因的表达情况。本实验结果表明：这些新的病原菌诱导型启动子在正常生长条件下具有较低水平的本底表达，能够快速介导下游基因在病原菌侵染处或伤口附近表达而且能维持较长时间，同时还能应答部分非生物胁迫。