氮磷营养盐对模型生态系统中粪肠球菌抗生素耐药形成的影响

摘要

目的：建立模型生态系统研究氮磷营养盐对粪肠球菌产生土霉素（OXY）、氨苄西林（AMP）、环丙沙星（CIP）、万古霉素（VAN）、氯霉素（CHL）、红霉素（ERY）耐药表型的影响，初步探讨氮磷营养盐对粪肠球菌产生土霉素、氯霉素和红霉素耐药的抗生素耐药基因（ARGs）机理。
　　方法：从福州森林公园采集土样，分装后高压灭菌。检测实验室保存的粪肠球菌纯菌株（ATCC29212）对试验用6种抗生素敏感性，结果表明除了对红霉素中介之外，对其他抗生素菌均敏感，可以作为试验用纯菌株。将增菌后的菌液与灭菌的土样搅拌均匀放入试验用水箱并加入纯水。按照此方法建立8个水箱，共4个剂量组，分别添加含氮量为0mg/L、1.50mg/L、4.5mg/L、12.5mg/L的硝酸铵（NH4NO3）以及含磷量为0mg/L、0.15mg/L、0.45mg/L、1.25mg/L的磷酸二氢钠（NaH2PO4）营养液，每个剂量组两个重复。采集第0d、1d、7d、14d、21d、28d、40d、60d、95d系统中的水样和泥样，水样用于检测富营养化的5个相关指标TN（Total Nitrogen）、TP（Total Phosphorus）、CODMn（Permanganate Index）、Chla（Chlorophyll-a）、SD（Secchi Depth），了解不同水箱中水质变化情况；泥样用于检测粪肠球菌对6种抗生素的敏感性，了解氮磷营养盐对粪肠球菌产生抗生素耐药性的影响。用PCR的方法检测土霉素耐药基因tetM、tetL、tetS，红霉素耐药基因ermB、msrC和mefA，氯霉素耐药基因cat以及肠球菌表面蛋白的esp基因。
　　结果：（1）不同剂量氮磷营养盐添加入系统之后，系统中低中高剂量组TN值出现明显梯度变化，使得TLI值在第7d时基本达到预期的轻度、中度、重度富营养化水平，第7d~21d之间，由于藻类繁殖不均衡，造成同一剂量组不同水箱之间的Chla和CODMn值出现差异，TLI指数也发生明显变化，而粪肠球菌对不同抗生素耐药现象从第7d开始出现，并持续到第60d不等，暗示着TN、Chla和CODMn指标的改变造成不同程度的富营养化对系统中粪肠球菌引发和维持对6种不同抗生素耐药有十分明显的影响。
　　（2）添加不同剂量氮磷营养盐对粪肠球菌分离率的影响不同，由于本试验是人为添加纯菌株，因此在第0d，8个水箱的分离率均达到了100%，第1~28d，低剂量组两个水箱，中剂量组3号水箱和高剂量组1号水箱中粪肠球菌的分离率均高于空白组，且与剂量呈正相关，而第40~60d，低于空白剂量组；中剂量组5号和高剂量组8号水箱中的粪肠球菌分离率均低于或等于空白剂量组。
　　（3）添加不同剂量氮磷营养盐可以引发粪肠球菌产生对土霉素、氯霉素、红霉素、环丙沙星以及氨苄西林的耐药；对土霉素耐药的影响与添加剂量呈正相关，高剂量组1号和8号分别在第21d和第7d出现土霉素耐药，之后缓慢升高，到第60d均达到最高值100%，中剂量组3号和5号均在第21d出现土霉素耐药，第60d达到最高值，低剂量组分别在第21d和28d开始出现土霉素耐药，最高值分别达到66.7%和100%；对氯霉素耐药影响随剂量增加而增大，高剂量组8号和中剂量组5号均在第7d就出现氯霉素耐药，且到第60d，耐药率分别达到66.7%和40%，低剂量组仅在第28d和60d出现氯霉素耐药；对红霉素耐药也与剂量呈正相关，高剂量组8号和中剂量组5号在第7d分别出现了14.3%和16.7%的耐药率，之后缓慢上升，第60d达到最高值；低剂量组7号在第21d出现50%耐药率，之后缓慢下降；仅高剂量添加组对环丙沙星耐药性产生明显影响，高剂量组8号在第7d就产生14.3%的环丙沙星耐药率，到第40d上升为50%，之后迅速下降至0，而高剂量1号仅在第40d出现33.3%的耐药率；仅中剂量组5号和低剂量组7号水箱在第21d出现50%和16.7%的氨苄西林耐药率，其余水箱均无明显变化，系统中未分离到粪肠球菌对万古霉素产生耐药。
　　（4）对土霉素耐药的37株粪肠球菌中，tetM、tetL、tetS基因的阳性率分别为97.3%、62.2%、18.9%，对土霉素敏感的39株粪肠球菌中，tetM、tetL、tetS基因的阳性率分别为89.7%、7.7%、0%；对氯霉素耐药的13株粪肠球菌中，cat基因的阳性率为69.2%，对氯霉素敏感的70株粪肠球菌中，cat基因阳性率为2.9%；检测了对红霉素耐药、中介、敏感的粪肠球菌各22、31、16株，ermB基因阳性率分别为77.3%、77.4%、75.0%，检测了对红霉素耐药、中介、敏感的粪肠球菌各22、40、13株，msrC阳性率分别为18.2%、0%、0%，检测了对红霉素耐药、中介、敏感的粪肠球菌57株，未发现mefA基因，检测了92株粪肠球菌，发现1株Esp基因阳性。
　　（5）系统中分离到的多重耐药菌株占耐药菌株总数的57.4%，其中2重耐药有19株，占35.2%，2重耐药表型中最多见的是OXY-ERY，其次是OXY-CHL；3重耐药有9株，占16.7%，其中OXY-CHL-ERY最多见；4重耐药表型共分离到3株，占5.6%。系统中耐药基因的阳性模式共检出12种，其中tetM-ermB和tetM-tetL-ermB两种模式出现频率最高。
　　结论：（1）添加氮磷营养盐可使模型生态系统中的粪肠球菌产生土霉素、环丙沙星、氯霉素和红霉素耐药，其中高浓度的TN对土霉素和环丙沙星耐药的产生影响较大，而高浓度的Chla值与粪肠球菌产生红霉素和氯霉素耐药的相关性较强。氮磷营养盐的添加对粪肠球菌产生氨苄西林耐药表型影响不明显，而对万古霉素则没有产生可检测到的影响。
　　（2）添加不同剂量氮磷营养盐对粪肠球菌产生土霉素、环丙沙星、氯霉素和红霉素耐药的影响各不相同。对土霉素耐药的影响最大，且与剂量呈正相关；随着添加剂量增大，对红霉素和氯霉素耐药性产生的影响越大，但同一剂量组的不同重复之间差异较大；对环丙沙星的影响大部分出现在高剂量组，中低剂量组对环丙沙星耐药性影响不明显。
　　（3）在添加氮磷前系统中已经存在tetM、tetL和ermB基因，而氮磷营养盐的添加可能对tetM、tetL和ermB基因起到诱导表达的作用，而系统中检测到的msrC基因阳性菌株均为高水平红霉素耐药株，cat基因的阳性率所占耐药株比率也很高，以及系统中检测到的esp基因都表明了氮磷营养盐导致粪肠球菌出现不同抗生素耐药性是多种机制共同作用的结果。

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引言

1 研究背景

2 肠球菌简介

3 富营养化的研究进展

4 环境细菌耐药性研究方法

5 本试验研究内容

6 本课题研究意义

第一章 氮磷营养盐对粪肠球菌抗生素耐药表型的影响

1 材料和方法

2 结果与分析

3 讨论

第二章 氮磷营养盐引发粪肠球菌对土霉素、氯霉素和红霉素

1 材料和方法

2 结果与分析

3 讨论

全文结论

参考文献

致谢