西方蜜蜂(Apis mellifera)王浆蛋白mrjp6和mrjp8的表达与功能研究

摘要

蜂王浆及主要蛋白组分王浆蛋白家族在蜜蜂生物学以及养蜂生产中具有十分重要的意义和作用，王浆蛋白家族共有10个成员，其中的MRJP1~5在蜂王浆中的含量很高，而 MRJP6~9的含量则极少甚至检测不到。为探究王浆蛋白家族中含量极少的成员MRJP6和MRJP8的基因表达与相关生物学功能，本课题对MRJP6基因在不同发育时期的三型蜂及其各组织部位的表达特性进行了研究，同时，利用RNA干扰技术系统的探讨了利用dsRNA干扰MRJP8基因的表达。具体结果如下：
　　首先，为了弄清 MRJP6基因在意大利蜜蜂体内的时空表达情况，为进一步的功能研究提供依据。本研究利用实时荧光定量 PCR技术对西方蜜蜂不同级型、发育时期和组织内的mrjp6表达量进行检测和分析。结果表明，mrjp6在蜜蜂幼虫和蛹期的表达水平较低，与对照基本一致，但在成年蜜蜂体内表达量显著提高，约为对照的25~28倍(p<0.05)；在成年三型蜂体内，其在雄蜂体内表达量低，约为对照的25倍，而在雌性的工蜂和蜂王体内表达量明显较高，可达28倍(p<0.05)。这说明mrjp6的表达与蜜蜂的性别有关。但其在工蜂和蜂王之间的表达没有差异，显示其表达与蜜蜂级型无关；进一步的研究表明，成年工蜂体内，mrjp6在哺育蜂和采集蜂体内表达量很高且比较稳定，通过对不同组织的检测表明该基因主要是在成年蜜蜂的头部特异性高表达。作为王浆蛋白家族的一员，mrjp6在成年雌性蜜蜂头部高水平表达，但又与典型的一般王浆蛋白在9日龄前后哺育蜂体内高表达、其他阶段低表达的模式不同，说明其具有不同于一般王浆蛋白的功能，分析其可能与蜜蜂神经系统的功能以及成年雌性蜜蜂复杂的行为发育模式有关。
　　其次，为了探究 MRJP8在意大利蜜蜂体内的生物学功能，揭示其表达机制，本课题设计了试剂盒合成dsRNA和工程菌合成dsRNA两种dsRNA合成途径，并通过饲喂和注射两种方法对 mrjp8进行干扰试验。结果表明，在用试剂盒合成 dsRNA的干扰试验中，1μg饲喂干扰条件下工蜂和蜂王的死亡率都很高，达到75％；当浓度降至50 ng时，饲喂干扰对死亡率几乎没有影响。两种不同浓度饲喂干扰试验对沉默工蜂和蜂王体内mrjp8的表达无效果。另一方面，利用1μg试剂盒合成dsRNA注射干扰刚出房工蜂的试验中，无论是蛋白层面还是基因层面都表现出试验组和对照组无差别。在用mrjp8-L4440-HT115工程菌诱导合成dsRNA的饲喂干扰试验中，饲喂的菌浓度越高工蜂的死亡率也越高。在4×109浓度工程菌饲喂干扰下，mrjp8在工蜂体内的表达量呈现下降趋势，但差异不显著。
　　本课题利用荧光定量技术全面定量分析了西方蜜蜂mrjp6的表达情况，发现mrjp6在三型蜂体内不存在级型差异，在雌性成年蜜蜂体内表达高于雄性蜜蜂，在工蜂体内存在头部特异性高表达，揭露其可能与蜜蜂神经系统功能和雌性成年蜜蜂发育有关。在利用dsRNA干扰西方蜜蜂mrjp8的试验中，饲喂dsRNA的方法使得成年工蜂死亡率升高，通过不同浓度对工蜂和蜂王进行饲喂干扰和注射干扰都没能使mrjp8表达量显著降低，试验结果显示mrjp8或许在蜜蜂的发育过程中有重要的作用，其功能不可替代，机体有相应的机制进行补偿表达，很难被成功干扰。

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第一章 蜜蜂王浆蛋白研究概述

1 蜂王浆及其生物学功能

1.1 蜂王浆的组分

1.2 蜂王浆的功能和作用

2 王浆蛋白(MRJPs)家族

2.1 MRJPs的发现和命名

2.2 MRJPs的分子研究概况

2.3 MRJPs的表达与功能研究概况

2.4 MRJPs的分子系统进化分析

3 荧光定量技术

3.1 荧光定量技术的发展及应用

3.2 比较CT法

4 基因干扰技术及其在蜜蜂RNAi中的应用

4.1 试剂盒合成dsRNA介导的RNAi

4.2 L4440-HT115工程菌介导的RNAi

5 本论文拟解决的问题

第二章 西方蜜蜂体内王浆蛋白MRJP6基因的表达

1 材料和方法

1.1 试验材料

1.2 试验方法

2 试验结果与分析

2.1 mrjp6引物验证

2.2 引物特异性检验

2.3 标准曲线建立

2.4 mrjp6在各期三型蜂中的表达

2.5 mrjp6在哺育蜂和采集蜂不同组织的表达

3 结论与讨论

第三章 利用试剂盒合成dsRNA干扰西方蜜蜂mrjp8的研究

1 材料和方法

1.1 试验材料

1.2 试验方法

1.3 数据分析

2 试验结果与分析

2.1 mrjp8的PCR扩增、质粒重组及基因克隆

2.2 mrjp8和egfp dsRNA的合成

2.3 dsRNA干扰结果与分析

3 结论与讨论

第四章 利用细菌表达dsRNA干扰西方蜜蜂mrjp8的表达研究

1 材料和方法

1.1 试验材料

1.2 试验方法

1.3 数据分析

2 试验结果与分析

2.1 mrjp8 dsRNA细菌表达载体的构建

2.2 mrjp8 dsRNA的诱导表达及纯化

2.3 egfp dsRNA表达体系的构建与诱导表达纯化

2.4 工程菌饲喂干扰工蜂结果分析

3 结论与讨论

第五章 总结与研究展望

参考文献

附录

致谢