两种甘蔗杆状病毒SCBIMV和SCBMOV实时荧光定量PCR检测方法的建立及应用

摘要

甘蔗杆状病毒（Sugarcanebacilliform viruses,SCBVs）属于花椰菜花叶病毒科Caulimoviridae杆状DNA病毒属Badnavirus，是危害甘蔗的主要病毒之一，在世界各主要甘蔗产区均有发现，严重影响甘蔗的产量和品质。因此，急需建立一种快速、灵敏、特异的检测方法，为阻止SCBV病毒跨区域传播，为该病害隔离检疫和健康脱毒种苗质量监控提供关键技术支撑。 本研究针对2012年国际病毒分类委员会ICTV公布的两个SCBV病毒种Sugarcane bacilliformIMvirus(SCBIMV，NC_003031)和Sugarcane bacilliform MO virus(SCBMOV，NC_008017)的反转录酶/RNA酶H(RT/RNase H)序列分别设计了一套特异性引物和探针，通过优化反应体系和条件，建立了灵敏度高、特异性强、重现性好的TaqMan实时荧光定量PCR（qPCR）检测方法。该方法以重组质粒PMD18T-IM（SCBIMV）和pSCBV20（SCBMOV）重组质粒DNA为模板（109-10拷贝/μL）进行荧光定量PCR检测，建立标准曲线和回归方程，其扩增效率分别为99.26%和101.73%，最低均能检测100拷贝/μL，比常规PCR灵敏度高100-1000倍。通过对不同SCBV株系/基因型的荧光定量PCR检测，两套qPCR检测方法均呈现良好的特异性。对采集自福州试验地国家区试甘蔗品（系）114份和云南蔗区甘蔗品种（系）62份叶片样品进行常规PCR和qPCR平行检测，常规PCR共检测到52份阳性样品，检出率为29.5%，其中，福州样品阳性检出率为41.23％，而云南样品阳性检出率为8.06％。利用本文建立的SCBIMV和SCBMOV的qPCR检测方法，在176份叶片样品中，阳性样品检出率分别为50.0%和46.6%。其中，福州、云南样品SCBIMV-qPCR方法阳性检出率分别为71.05％和11.29％，而福州、云南样品SCBMOV-qPCR方法阳性检出率分别为57.01％和27.41%，这些结果显示qPCR方法阳性样品检出率明显高于常规PCR，表明qPCR检测方法具有更高的灵敏度。 对52份阳性样品的常规PCR产物进行克隆和测序，共获得80条SCBV病毒RT/RNase H片段序列，连同已报道的38条代表18个不同SCBV基因型/株系为参考序列，利用邻接法构建系统进化树，结果表明所有供试的SCBV分离物划分成19个亚组群，即SCBV-A至SCBV-S，其中SCBV-S为本研究新发现的基因型/株系。本研究获得的福州SCBV分离物划分在E、F、L、N和Q组群，而云南SCBV分离物划分在Q、R和S组群。 综上所述，本研究建立的SCBIMV、SCBMOV荧光定量PCR方法为SCBV的检验检疫和病害防控提供准确可靠、灵敏、快速的检测技术。发现福州试验地国家区试甘蔗品（系）和云南蔗区甘蔗品（系）存在多种SCBV株系或基因型，加强我国SCBV病毒的隔离检疫和病害流行监测势在必行。

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