中巴蜻蜓分布和遗传多样性及其相关单链DNA病毒鉴定

摘要

蜻蜓目昆虫由6000多个种组成，广泛分布于世界各地，俗称蜻蜓或豆娘。蜻蜓（目）以蚊子等小型昆虫为食。已有研究表明在特定环境下释放蜻蜓若虫可以起到生物防治的作用。另外，最近有研究者从蜻蜓中分离出几十种环状单链DNA（ssDNA）病毒。提出，作为一个顶级昆虫捕食者，蜻蜓是一种昆虫ssDNA病毒的富集“机器”。因其进化上的多样性、生态型和表型的可塑性以及生命周期的复杂性，蜻蜓正在吸引越来越多研究者的目光。不过，目前关于蜻蜓的分子水平的研究还是较少。 在本研究中，我们从2014到2017年在中国中部、南部以及巴基斯坦的西南部采集了大量的蜻蜓。然后，我们通过COI基因测序对这些蜻蜓进行了分子鉴定，并以滚环扩增技术从采自福州的蜻蜓中富集和鉴定了ssDNA病毒。对所得COI序列，我们以BioEdit v6中的Clustal-W进行比对，通过邻接法进行系统发育树构建；用MEGA7通过Kimura2参数计算遗传距离，并以DnaSP v5计算遗传多样性。此外，我们还分析了核苷酸错配分布以确认所有序列的遗传多样性。对ssDNA病毒序列，我们也以类似方法进行了分析。 序列分析表明，我们从中国中部（武汉）和巴基斯坦（5个地点）采集了67个不同种的蜻蜓，它们可以归为15个不同的属，两个不同的科（Gomphidae和Libellulidae）。在种的水平上，猩红蜻蜓（Crocothemis servilia）遗传多样性最高，为24.96%，Libellulidae sp.次之，为22.30%。遗传多样性最小的为Melligomphus ardens（0.82%）。总体来讲，我们所获得的序列一共有341个突变位点。其中，猩红蜻蜓突变位点最多，为176个。Libellulidae sp.次之，为150个。而Melligomphus ardens仅有3个突变位点。一个意外的发现是，尽管所有的中国猩红蜻蜓都采自武汉这一个城市，而巴基斯坦的猩红蜻蜓采自相距超过500公里的多个地点，在猩红蜻蜓的遗传多样性上，中国明显高于巴基斯坦。 对采自中国南部的蜻蜓，我们获得了61条COI序列。分析表明，这些蜻蜓可以归为16个不同的种，分属于11个不同的属和3个不同的科（Aeshnidae,Gomphidae and Libellulidae）。赤蜻属（Trithemis）遗传多样性最高（18.69%），灰蜻属（Orthetrum）次之(18.16%)，而多样性最低的为黄蜻属（Pantala，0.31%）。从赤蜻属和灰蜻属序列中，我们分别发现了142和126个突变位点，而从黄蜻属序列中我们仅发现了2个突变位点。总的来讲，我们共从三个科的蜻蜓中发现404个突变位点，其中，从Libellulidae中发现了344个。 此外，序列分析表明，我们从中国南部采集的蜻蜓（目）中，还有10个豆娘种，分属于7个不同的属，4个不同的科。在属的水平上，鼻蟌属（Rhinocypha）遗传多样性最高（9.31%），Hetaerina次之（8.23%），而黄蟌属（Ceriagrion）和异痣蟌属（Ischnura）遗传多样性较低，分别在0.32%和0.48%。我们分别从Hetaerina和鼻蟌属发现了181和68个突变位点，而从黄蟌属和异痣蟌属，我们仅分别发现了2个和6个突变位点。从科的水平讲，4个不同的科之间具有显著差异，这种差异的显著性可以通过Tajima’s D和Fu’s Fs两种检测。 我们从福州的蜻蜓中发现了3种cycloviruses，分别将其命名为蜻蜓相关Cyclovirus-9-11(DfCyV-9,-10,-11)。这三种Cycloviruses在全基因组水平上的同源率在61.6-65.1%，而它们与已正式确立的Cycloviruses间的同源率在56.1-79.6%。根据cycloviruses的分类标准，DfCyV-9,-10和11各自代表一个cyclovirus新种。值得指出的是，DfCyV-10所编码的Rep蛋白与蝙蝠相关cyclovirus2(BatACyV-2，一个来自于中国的cyclovirus)的Rep高度同源，其氨基酸水平的相似性为79.4%，然而，DfCyV-10所编码的Cp蛋白却与BatACyV-10（一个来自于巴西的cyclovirus）的Cp蛋白高度同源，其氨基酸水平的相似性为71.7%。 尽管研究者已对蜻蜓（目）有了较多的研究，但对世界上的很多地区来讲，关于蜻蜓的分子水平的数据还是空白。本研究以分子生物学手段从中国和巴基斯坦鉴定到30多个蜻蜓种，揭示了这两个国家蜻蜓的遗传多样性。另外，本研究还从中国福州的蜻蜓分离到3个cyclovirus新种。这些数据将为进一步研究和认识蜻蜓以及它们所携带的ssDNA病毒奠定坚实的基础。

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摘要

Abstract

1. Introduction

Table 1 Scientific classification of Odonata Fabricius [54]

1.1. Etymology and terminology

1.2. Systematics and taxonomy

1.3. External morphology

1.4. Description

1.5. Ecology and life cycle

1.6. Phylogeny

1.7. Anisoptera

1.7.1. General description and biology

1.7.2. Distribution, diversity and dispersal

1.8. Zygoptera

1.8.1. General description and biology

1.8.2. Distribution, diversity and dispersal

1.9. Molecular identification of odonates

Table 4 Molecular identification of odonates through different mitochondrial gens

1.10. Why Identification of odonates in Pakistan and China is important?

1.11. Cyclovirus

1.11.2. Structure

1.11.4. Taxonomy

1.12. Molecular identification of cyclovirus from insects

1.13. Aims of study

2. Material and methods

2.1. Sample collection

2.2. Sample preparation

2.3. DNA extraction of odonates

2.3.1. COI PCR amplification

2.3.3. Gel electrophoresis and photographing

2.3.4. Gel Extraction and purification procedure

2.3.5. Sequence analysis

2.3.6. Genetic distance and Phylogenetic Analysis of COI Sequences

2.3.7. Genetic diversity and distribution analysis

2.4. DNA Extraction Procedure of odonates (For viruses)

2.4.1. Enrichment of viral recovery

2.4.2. Rolling Circle Amplification (RCA)

2.4.3. Fast Digestion

2.4.4. Ligation

2.4.5. Transformation

2.4.6. Check PCR analysis

2.4.7. Vector construction method

2.4.8. Digestion

2.4.9. CutP-protocol or Reaction

2.4.10. Phylogenetic analysis

2.4.11. Pairwise identity analysis

3. Results

3.1. Genetic diversity of dragonflies from central China and Pakistan

3.1.1. Phylogenetic analysis of COI sequences

3.1.2. Genetic distance divergence (%) distributions among species and families

3.1.3. Genetic diversity

3.2. Genetic diversity of dragonflies from South-China

Figure 9 Map of Anisopteran species distribution in South-China

3.2.1. Phylogenetic analysis of COI gene

3.2.2. Genetic distance divergence (%) distribution among genus and families

3.2.3. Genetic diversity

3.3. Genetic diversity of damselflies from South-China

3.3.1. Phylogenetic analysis for COI gene

3.3.2. Genetic distance divergence (%) distributions among genera and families

3.3.3. Genetic diversity

3.4. Diversity of odonates associated ssDNA viruses

Figure 19 Phylogenetic analyses of ssDNA viruses

Figure 20 Pairwise identity of cycloviruses

Figure 21 Pairwise comparison for identity of cycloviruses

4. Discussion

4.1. Genetic diversity of dragonflies from central China and Pakistan

4.2. Genetic diversity of dragonflies from South-China

4.3. Genetic diversity of damselflies from South-China

4.4. Diversity of odonates associated ssDNA viruses

5. Conclusion

5.1. Anisopteran diversity from central China and Pakistan

5.2. Anisopteran genetic diversity from South-China

5.3. Zygopteran genetic diversity from South-China

5.4. Diversity of odonates associated ssDNA viruses

References

Appendix

Equipment’s used during research

List of supplementary figures

List of Published papers during the Program

Acknowledgment