小鼠pEGFP-NeuroD重组质粒的构建及其在肝癌细胞中的表达后功能的初步探讨

摘要

实验目的： 神经分化因子1（NeuroD-1）又名B细胞E盒转录激活因子2（BETA-2），属于组织特异性的B类bHLH蛋白，作为转录因子，NeuroD-1基因是β细胞特异和有效表达胰岛素基因所必需。在基因敲除小鼠的研究中发现[1]，BETA-2基因缺失的小鼠因为β细胞数量的大量减少和缺少适量的胰岛形成，出现严重的糖尿病并在围产期死亡。最近cao[2]等应用基因转染方法将表达PDX-1的基因体外转染肝细胞，结果发现在高糖条件下肝细胞被诱导分泌胰岛素。这就提示，在一定条件下，胰岛素在肝脏的异位表达是可以实现的。本实验拟构建pEGFP-NeuroD表达质粒载体，体外转染肝癌细胞（HepG2），观察HepG2细胞在不同条件下NeuroD-1和胰岛素的表达，从而探讨体外表达NeuroD-1诱导肝癌细胞分泌胰岛素的可能性。 实验方法： 1.以重组质粒Pcr3.1-NeuroD为模板，用PCR方法扩增出NeuroD-1基因，构建入含增强绿色荧光蛋白的表达质粒pEGFP-Cl，构建可以表达NeuroD-1基因的质粒载体pEGFP-NeuroD。 2.将表达质粒pEGFP-NeuroD用脂质体法转染三种不同葡萄糖浓度培养的HepG2细胞，荧光显微镜下观测绿色荧光蛋白的表达；利用RT-PCR方法检测NeuroD-1及胰岛素的表达；用Western Blot检测NeuroD-EGFP融合蛋白的表达。 实验结果： 1.成功构建了pEGFP-NeuroD表达质粒。 2.重组质粒体外成功转染入HepG2细胞，在荧光显微镜下可见强绿色荧光蛋白的表达，重组质粒转染率在30～40％之间；RT-PCR方法及Western Blot在三种不同葡萄糖浓度培养的HepG2细胞组中均检测到NeuroD-1的表达，其中RT-PCR方法扩增出NeuroD-1 mRNA大小是634bp，NeuroD-EGFP融合蛋白Mr大小67×103，但是三组间基因表达量均无明显差异。 3.RT-PCR法未检测到肝癌细胞胰岛素的表达分泌。 实验结论： 1.利用pEGFP-Cl带有绿色荧光蛋白序列，为报告基因的特点，构建了表达融合蛋白NeuroD-EGFP的载体。 2.pEGFP-NeuroD真核表达载体在肝癌细胞内成功表达融合蛋白NeuroD-EGFP，但是未从肝癌细胞中诱导出胰岛素的表达，功能探讨提示单一NeuroD-1表达质粒的转染可能不足以诱导肝癌细胞分泌胰岛素。

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文摘

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前言

第一部分小鼠pEGFP-NeuroD重组质粒的构建

1材料与方法

2结果

3讨论

第二部分pEGFP-NeuroD重组质粒在肝癌细胞中的表达后功能的初步探讨

1材料与方法

2结果

3讨论

全文总结

参考文献

文献综述：NeuroD-1/BETA-2基因和糖尿病

致 谢

攻读学位期间发表的学术论文