福尔马林固定不同时间石蜡包埋组织DNA降解程度及SNP分型的研究

摘要

背景 福尔马林固定石蜡包埋组织（Formalin Fixed and Paraffin Embedded Tissues，FFPET）是病理学、法医病理学进行疾病诊断和科学研究的常用检材，并被长期保存，亦是涉嫌保险欺诈，医疗纠纷，财产继承等刑事、民事案件的法医物证检材。目前，国内医院及科研机构大多使用普通10％甲醛固定人体组织，普通福尔马林溶液固定人体组织中DNA降解相对比较严重，提取高质量的DNA并进行PCR-STR分型较为困难。这使FFPET成为法医物证疑难检材之一。检测FFPET也成为法医物证学研究的重点和难点。 联合DNA索引系统（CODIS）13个核心STR基因座的Plus和Cofiler等试剂盒，虽已广泛应用于血液、唾液、上皮组织、发根及骨组织的基因分型，但仍不能对FFPET进行准确分型。研究表明，福尔马林固定时间、切片厚度以及不同的脱蜡方法均可影响FFPET提取DNA的质量，从而影响其基因分型。而且不同组织的DNA降解程度有所不同。通过优化蛋白酶消化条件，精简DNA提取步骤和纯化DNA模板虽能提高DNA纯度和减少DNA额外损伤，但并不能给FFPET的基因分型带来本质的改观；通过增加循环次数或采用巢式PCR等对PCR方法进行调整与改良，可以提高扩增产物量或扩增特异性，但并未明显改善其检出率。因此，越来越多的学者将研究的重点转移到如何有效地缩短扩增产物片段长度，以克服FFPET检材中DNA严重降解对基因分型的影响，从而提高FFPET基因分型的成功率。大公司竞相研发出扩增片段较小的miniSTR商品化检测试剂盒，提高了对降解DNA检材的分型成功率，但仍然普遍存在诸如等位基因或位点丢失、不平衡峰、Pull-up峰等问题，影响了在实际检案中的应用。 单核苷酸多态性（Single Nucleotide Polymorphism，SNP）通常是指人类基因组中特定部位的单个碱基序列的变异。人类基因组中SNP含量丰富，每个个体存在数百万个SNP。由于很多原因，SNP引起法医工作者的关注。首先，SNP的PCR扩增产物长度可以小于100bp，而STR的扩增产物都为300-400bp，因此SNP比STR更适用于降解的DNA样本。第二，样品的处理和数据分析易于自动化。第三，它的每个等位基因上不出现stutter带，有助于简化等位基因分析。在法医学领域，SNP最大的优点就是可以得到短的PCR产物，从而为解决FFPET基因分型的难题提供了新的思路和途径。 目的 本研究探讨不同时间福尔马林固定石蜡包埋组织DNA降解情况，保证扩增产物片段长度小于100bp为基本条件，针对具有较高杂合度的SNP基因座自行设计等位基因特异性引物，通过SNP基因座与STR（D2S441）基因座对FFPET检材基因分型结果的比较，探讨采用短扩增子ASPCR技术对FFPET进行SNP分型的可行性与优越性。并调查了rs1454361、rs2046361基因座在中国重庆汉族群体的频率分布。 实验分为两部分 一、福尔马林固定不同时间石蜡包埋组织DNA降解程度与SNP分型成功率的研究 材料与方法： 1、FFPET取自重庆医科大学法医学教研室，3个例尸体解剖提取的肝脏、肺脏、皮肤、骨骼肌、脑，用福尔马林溶液固定5d，10d，15d，按常规方法制作FFPET样品，切取10μm厚切片，每4片放入一个1.5ml的无菌离心管中。同时取上述尸体心脏血各2ml作为阳性对照。（同时常规切片HE染色，显微镜下观察确保组织结构清晰，无自溶、坏死、和大片出血） 2、采用琼脂糖凝胶电泳对FFPET样本的DNA进行质量检测。 3、分别应用SNP-ASPCR技术与PCR-STR技术对FFPET检材进行基因分型，并对两者的分型成功率与分型效果进行比较。 结果 1、琼脂糖凝胶电泳显示，血液样品提取DNA的电泳谱带纤细清亮，电泳迁移率低；FFPET样品提取DNA的电泳谱带成弥散状，电泳迁移率高。通过与DNA Marker比较，片段长度主要分布于200bp以下，5d组各FFPET样品片段长度主要分布于100bp-200bp，10d组脑组织片段长度主要分布于50bp以下，其余分布100bp左右，15d组只有肝脏样品片段长度分布于100bp，其余分布于50bp以下。 2、采用ASPCR技术对rs1454361与rs2046361基因座进行分型，5d组rs1454361的检出率为14/15（有1例脑组织来源的FFPET样品未检出PCR产物），rs2046361的检出率为13/15（有2例脑组织来源的FFPET样品未检出PCR产物）。10d天组脑组织来源的FFPET样品全部未检出PCR产物，其余各脏器来源的FFPET样品的检出率也下降，rs1454361的检出率为7/15，rs2046361的检出率为6/15。15d组仅仅肝脏来源的FFPET样品有检出PCR产物。rs1454361的检出率为2/15，rs2046361的检出率为1/15。通过与阳性对照结果比对，均分型正确，其谱带亦清晰可辨。采用PCR-STR分型技术对D2S441检测结果显示：部分样品泳道浓染，谱型发生明显改变，导致无法判型，部分样品未检出相应的扩增产物。 二、中国重庆地区汉族群体rs1454361与rs2046361基因座遗传多态性研究 材料与方法 119例中国重庆地区无血缘关系个体血液样品，由重庆医科大学法医学教研室分子生物学实验室提供。采用短扩增子ASPCR技术建立rs1454361、rs2046361基因座分型系统，检测该基因座在中国重庆地区汉族群体样本中的多态分布，直接计数法计算其基因型频率与等位基因频率，并进行Hardy-Weinberg平衡检验。采用PowerStatesV12软件计算其法医学应用指标。 结果 119例中国重庆地区无血缘关系个体中：rs1454361：TT型32例（26.89％），TA型56例（47.05％），AA型31例（26.05％），T等位基因与A等位基因频率分别是0.5042和0.4958；rs2046361：TT型29例（24.37％），TA型69例（57.98％），AA型21例（17.65％），T等位基因与A等位基因频率分别是0.5336和0.4664。采用X2检验进行Hardy-Weinberg平衡检验的结果为rs1454361：X2=0.4108，p>0.05；rs2046361：X2=3.2370，p>0.05。应用 PowerStatsV12对 rs1454361与rs2046361基因座群体调查结果进行数据分析，获得如下法医学应用参数：rs1454361/ rs2046361基因座H、DP、Pm、PE、PIC分别为0.471/0.58、0.638/0.573、0.362/0.427、0.163/0.267、0.37/0.37。 结论 1、福尔马林固定后的FFPET样品提取的DNA高度降解，肝脏降解最轻，脑组织降解最严重。片段长度主要分布在200bp以下，集中于100bp左右。 2、SNP-ASPCR技术在对FFPET之类高度降解DNA检材的基因分型方面，具有较高的检出成功率，其效果明显优于PCR-STR技术。 3、rs1454361与rs2046361基因座在中国重庆汉族群体中具有良好的多态性分布，在法医学上具有较高的应用价值。

目录

文摘

英文文摘

论文说明：英汉缩略语名词对照

声明

前 言

第一部分 福尔马林固定不同时间石蜡包埋组织DNA降解程度与SNP分型成功率的研究

1材料与方法

2.实验结果

3讨论

结论

参考文献

第二部分中国重庆地区汉族群体rs1454361与rs2046361基因座遗传多态性研究

1材料与方法

2实验结果

3讨论

参考文献

全文小结

文献综述：福尔马林固定石蜡包埋组织DNA提取方法的比较

致 谢

攻读硕士期间发表的论文