HBV逆转录酶特定变异对其药物敏感性的影响

摘要

乙型肝炎病毒（hepatitis B virus，HBV）感染是全球性公共卫生问题，核苷类似物是目前治疗慢性乙肝的重要药物，但长期使用核苷类似物易发生耐药，耐药己成为乙肝抗病毒治疗中的重要热点问题。耐药现象的一个重要原因是HBV逆转录酶（RT）发生耐药突变，RT特定突变与耐药有确定关系。研究HBV耐药突变，很重要的一环是临床病毒株的体外表型分析。由于缺乏有效的HBV体外感染模型，现有HBV体外表型分析主要依赖重组HBV DNA体外转染系统。在这种背景下，一种可支持HBV体外复制的HBV DNA重组体就显得十分关键了。体外可复制的HBV DNA重组体至少需包含1.1倍以上的HBV基因组，限于HBV基因组的松弛环状特殊结构，及其开放读码框的高度重叠性，构建体外可复制重组体殊为困难。本研究建立了一种新策略，可以用来构建HBV1.1×基因组重组体。利用该策略，我们研究了RTS246T变异对HBV Entecavir体外敏感性的影响，以及RT N118H变异对Adefovir体外敏感性的影响。
　　 目的：建立一种构建HBV1.1×全基因组重组体的新策略，利用该策略，分析临床样本中含有特定变异的病毒株对核苷类药物的体外敏感性。
　　 方法：
　　 1.以片段置换反应（Fragment Substitution Reaction，FSR）为核心，建立HBV1.1×全基因组重组体构建新策略；
　　 2.选择一例 Entcavir治疗反应不佳的患者，分离其血清HBVDNA，构建含有RT S246T变异的HBV1.1倍体，转染HepG2细胞，进行体外ETV药敏分析；
　　 3.选择三例 Adefovir治疗反应不佳的患者，分离其血清HBVDNA，构建含有RTN118H变异的HBV1.1倍体，建立稳定复制HBV细胞系，进行体外ADV药敏分析。
　　 结果：
　　 1.片段置换反应（FSR）可以有效地将DNA片段插入载体目标位置。当待替换片段与被替换片段同源性较高时，FSR高效且简便；
　　 2、利用片段置换反应构建的HBV1.1×全基因组重组体均可支持HBV体外复制；
　　 3.含有RT S246T变异的HBV在体外的ETV IC50为0.99±0.09nM，与野生株相比，差异不明显；
　　 4.含有RT N118H变异的HBV在体外的ADV IC50为0.076±0.010μM，与野生株相比，无显著差异。
　　 结论：我们成功建立了一种新的分子克隆方法，即片段置换反应（FSR），其优点是可以绕过酶切连接步骤，将DNA片段插入载体。FSR方法在很多情况下（例如没有合适的酶切位点时），较传统酶切链接克隆方法更为灵活有效，由于这一特点，该方法在分子生物学研究方面有广泛应用前景。基于FSR，我们发展了一种新的体外可复制HBV1.1倍体构建策略，该策略允许我们很方便地从患者血清样本HBV DNA构建HBV1.1×重组体，从而大大方便了HBV表型分析相关研究。利用该策略，我们对一例ETV部分反应患者，及三例ADV治疗反应不佳患者血清HBV进行了表型分析，首次证实含有RTS24.6T变异的HBV对ETV仍然敏感，而含有RT N118H变异的HBV对ADV也仍然敏感，RT aa246及RT aa118位点在ETV及ADV耐药中的作用较小，提示当患者出现aa246及aa118突变时，使用ETV及ADV治疗仍然有效。