人SARP1基因酵母双杂交诱饵载体的构建、表达鉴定及自激活和毒性检测

摘要

目的：构建人SARP1基因酵母双杂交诱饵载体，为鉴定SARP1基因相互作用蛋白、探讨SARP1基因在瘢痕组织中的生物学功能奠定基础。
　　 方法：根据genebank中查到的SARP1的mRNA序列，设计分别带有NdeⅠ和SalⅠ酶切位点的上、下游引物，人工合成SARP1基因片段，选择pTA2作为克隆载体，扩增SARP1基因片段，用NdeⅠ和SalⅠ分别双酶切pTA2-SARP1 PCR产物和pGBKT7载体，胶回收后对二者进行连接，构建含pGBKT7-SARP1基因的重组质粒。以重组质粒pGBKT7-SARP1转化E.coli DH5α感受态细胞，卡那霉素筛选阳性克隆，分别对挑选的阳性克隆用NdeⅠ和SalⅠ进行双酶切、凝胶电泳及测序，以鉴定重组质粒pGBKT7-SARP1中插入的SARP1序列的完整性和可靠性。根据Clontech公司的酵母杂交操作手册，用醋酸锂法（Li-Ac）将序列正确的重组质粒pGBKT7-SARP1转化入AH109酵母菌株，在缺陷性培养基上观察pGBKT7-SARP1在AH109中的表达情况，检测诱饵载体有无毒性作用和自激活效应。
　　 结果：酶切后凝胶电泳及DNA测序证实pGBKT7-SARP1基因重组载体构建正确，对酵母菌株AH109无毒性，且不具自主激活报告基因的效应。
　　 结论：成功构建了pGBKT7-SARP1基因重组酵母双杂交诱饵载体，为进一步用酵母双杂交方法鉴定SARP1基因相互作用蛋白、探讨SARP1基因在瘢痕成纤维细胞生物学功能奠定实验基础。