Toll样受体2/4在高氧所致急性肺损伤炎症反应中的作用及其机制的研究

摘要

第一部分、高氧所致大鼠急性肺损伤Toll样受体2、4的变化
　　 目的：探讨Toll样受体（TLRs）在高氧所致急性肺损伤发病过程中的变化及作用。
　　 方法：将24只SD大鼠置于氧体积分数大于95％的密闭氧仓中，分别于氧气暴露24、48、72h，8只呼吸正常空气的SD大鼠作为对照组，活杀各组大鼠，取肺组织标本，测定肺湿/干重（W/D）比值以及肺组织形态学改变。用实时定量（real-time）PCR测定肺组织TLR2/TL，R4基因的表达；用免疫印迹（Western Blotting）测定肺组织TLR2/TLR4蛋白的表达；用酶联免疫吸附法（ELISA）测定肺组织匀浆中IL-6的蛋白含量。
　　 结果：各高氧实验组肺W/D比值较对照组明显增高（P<0.01），随高氧暴露时间的延长，肺组织呈现弥漫性肺泡炎和间质水肿等病理学改变。Real-time PCR结果显示高氧暴露组肺组织TLR2/TLR4基因表达明显高于对照组（P<0.05），并与24h达高峰。western Blotting结果显示，高氧组TLR2/TLR4蛋白表达较对照组明显增高（P<0.05），峰值分别在48h、72h；ELISA结果显示高氧组肺组织匀浆IL-6蛋白含量较对照组明显增高（P<0.05），48h达高峰。
　　 结论：在高氧引起急性肺损伤中，TLR2/TLR4在肺组织的炎症的启动和维持中起重要的作用。
　　 第二部分、高氧所致氧化应激状态下肺泡上皮细胞Toll样受体2/4表达及其功能研究
　　 目的：观察高氧暴露后，肺泡上皮细胞内ROS水平与TLR2/4基因、蛋白表达变化及其信号通路的功能之间关系，探讨高氧所致肺损伤炎症反应的可能机制。
　　 方法：体外培养人类肺泡Ⅱ型上皮细胞株A549，分别在>90％氧体积分数高氧环境中暴露2h、6h、12h、24h及48h后（1）用流式细胞术检测细胞内活性氧含量；（2）用real-time PCR法检测TLR2/4基因表达变化；（3）用流式细胞术检测TLR2/4蛋白在细胞中的分布及其表达改变；（4）用EMSA检测A549在高氧暴露后，细胞内NF-KB核转录的变化；（5）用ELIsA检测A549在高氧暴露后，上清液中IL-6，IL-8的含量；（6）A549细胞予以ROS清除剂NAC预处理后，高氧暴露6h，再分别测定①用流式细胞术检测细胞内ROS含量；②real-time PCR法检测TLR2/4基因表达变化；③用流式细胞术检测TLR2/4蛋白表达改变；④用EMsA检测细胞内NF-KB核转录的变化；⑤用ELISA检测A549在高氧暴露后，上清液中IL-6，IL-8的含量。
　　 结果：A549肺泡上皮细胞有TLR2/4的表达，并且以胞内表达为主，随高氧暴露时间的延长，胞内ROS含量呈进行性增高，TLR2/4表达随之进行性增高，细胞内NF-κB核转录水平及细胞上清液中IL-6，IL-8水平也呈进行性增高；在NAC预处理的情况下，高氧刺激后，细胞内ROS水平明显降低，细胞TL，R2/4表达也随之降低，NF-κ B核转录活性水平及细胞上清液中IL-6，IL-8水平增高不明显，其变化与正常空气A549细胞组无统计学差异，而明显低于高氧暴露对照组。
　　 结论：A549细胞在高氧暴露后，细胞内ROS能够激活人肺泡上皮细胞TLR2/4的表达，导致前炎症细胞因子IL-6和IL-8的大量释放。这一过程可能是通过TL2/TLR4-NF-kB-炎症介质这一信号转导通路实现的。
　　 第三部分、siRNA-TLR2和siRNA-TLR4对高氧所致氧化应激状态下肺泡上皮细胞功能的影响
　　 目的：观察siRNA-TLR2和siRNA-TLR4转染的A549细胞高氧暴露后，细胞TLR2/4基因、蛋白表达变化及其下游信号通路的功能，进一步证实细胞内ROS可激活TL2/TLR4-NF-kB-炎症介质这一信号转导通路，导致高氧肺损伤炎症反应的启动。
　　 方法：体外培养人类肺泡Ⅱ型上皮细胞株A549，分别转染siRNA-TLR2和siRNA-TL，R4，在>90％氧体积分数高氧环境中暴露6h后（1）用real-time PCR法检测TLR2/4基因抑制效率；（2）用流式细胞术检测TLR2/4蛋白抑制效率；（3）用EMSA检测转染后A549在高氧暴露后，细胞内NF-KB核转录的变化；（4）用ELISA检测转染后A549在高氧暴露后，上清液中IL-6，IL-8的含量；
　　 结果：siRNA-TL.R2和siRNA-TLR4可明显抑制A549肺泡上皮细胞高氧暴露后TLR2/4的表达，并且可以降低高氧暴露后细胞内NF-κ B核转录活性水平及细胞上清液中IL-6，IL-8水平，与正常空气A549细胞组比较无统计学差异，而明显低于高氧暴露对照组。
　　 结论：高氧暴露下上皮细胞内ROS可激活TLR2/4-NF-KB-炎症介质信号通路，导致细胞分泌前炎症细胞因子IL-6，IL-8。