SPD1672蛋白的关键功能域鉴定及其对不同血清型肺炎链球菌合成磷壁酸和毒力的影响研究

摘要

目的：
　　磷壁酸(Teichoic Acids)是革兰阳性细菌细胞壁上一种的多糖聚合物，是细菌表面重要的抗原。spd1672基因是本课题组前期筛选出的一个体内诱导基因，生物信息学分析显示该基因在各种血清型肺炎链球菌中的高度保守性，其编码产物具有O抗原连接酶、聚合酶结构域。前期实验结果显示SPD1672蛋白影响了2型肺炎链球菌D39菌株的毒力和磷壁酸合成，可能为磷壁酸合成酶，但其关键结构域尚不清楚。因此本课题拟鉴定SPD1672蛋白影响磷壁酸的关键结构域，并观察其在其它血清型肺炎链球菌中是否也影响到磷壁酸合成及毒力。
　　方法：
　　首先通过替代失活的方法构建肺炎链球菌D39(serotype2)、R6(serotype2)、203(serotype3)、TIGR4(serotype4)的spd1672基因缺陷菌株D39△1672、R6△1672、203△1672、TIGR4△1672，利用pEVP3质粒构建以上各菌株的周质环extemal loop4(EL4)缺陷菌株和spd1672基因的回复菌株，通过突变PCR技术构建5个周质环点突变回复菌株，通过western blot检测野生菌与缺陷菌的各亚组分中磷壁酸合成的差异，鉴定SPD1672蛋白的酶活性位点，并分析其在不同菌株中对壁磷壁酸(WTA)与脂磷壁酸(LTA)合成的影响；采用PJWV25及PAE03质粒荧光报告系统，对SPD1672蛋白进行亚细胞定位分析；通过小鼠生存率的比较、体内定植实验等的毒力实验分析spd1672基因对不同血清型肺炎链球菌毒力的影响。
　　结果：
　　通过western blot分析发现，D39菌株缺陷周质环EL4后的磷壁酸合成减少，与缺陷spd1672基因后相一致，说明EL4是其关键功能域；进一步的酶活性位点分析实验发现，第206、270、287、306位氨基酸点突变后磷壁酸的合成量同野生菌相比几乎没有差异，而第304位组氨酸发生点突变后，其磷壁酸的合成量同缺陷spd1672基因后相一致，较野生菌显著下降，提示该位点为SPD1672蛋白的关键氨基酸；选择抗磷酸胆碱抗体对野生菌及各点突变菌株进行的磷酸胆碱含量分析显示，各突变株的磷酸胆碱变化与磷壁酸含量的变化一致，进一步证实上述结论的可靠性。spd1672基因的N末端和C末端分别与GFP融合表达后，肺炎链球菌的边缘发出荧光，提示该基因表达于细胞膜上。对3型菌株203和4型菌株TIGR4的磷壁酸合成检测结果显示，当缺陷spd1672基因后，缺陷菌全菌组分及各亚组分磷壁酸的合成量都显著减少，说明spd1672基因在这两种血清型菌株中也影响磷壁酸的合成；通过鼻腔的途径感染小鼠，结果发现D39△1672、203△1672、TIGR4△1672同野生菌相比，其在血、鼻咽部、肺及脑中的定植量较野生菌显著减少，缺陷组的小鼠生存率显著高于相应的野生组的小鼠生存率。
　　结论：
　　本研究结果提示SPD1672蛋白表达于细胞膜，周质环EL4是其重要的结构功能域，第304位组氨酸是维持其聚合酶活性的关键氨基酸。spd1672基因对2型、3型等血清型菌株的磷壁酸合成都有影响，且影响这些菌株在宿主体内的定植及毒力，提示该基因对肺炎链球菌磷壁酸合成及毒力的影响具有普遍性。